Isolamento de miócitos atriais humanos para Medições Simultâneas de Ca^{2 +} Transitórios e correntes de membrana

Protocolos experimentais precisa ser aprovado pelo comitê de ética local e todos os pacientes precisam dar consentimento informado por escrito. Nossa pesquisa foi aprovado pelo comitê de ética da Faculdade de Medicina de Mannheim, da Universidade de Heidelberg (# 2011-216N-MA) e foi realizado em conformidade com todas as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano. Todos os pacientes assinaram termo de consentimento. 0. A obtenção de tecido atrial humano Durante os procedimentos de rotina de punção, em pacientes submetidos a cirurgia de coração aberto de circulação extracorpórea, a ponta da aurícula direita é normalmente removida e pode ser usada para o isolamento dos cardiomiócitos atriais. Após a excisão da amostra de tecido é transferido imediatamente para um tubo Falcon de 50 ml estéril com Ca2 + livre transporte solução contendo 2,3-butanodiona monoxime (Tabela I; BDM, inibidor contráctil, impedindo miócitos contracture). Com o tempo de transporte entre 30 e 45 min, que não reconhecemos uma clara vantagem de arrefecimento ou oxigenação em relação ao número e qualidade dos cardiomiócitos atriais isoladas. Nos transportes em geral para o laboratório deve ser tão rápido quanto possível. No entanto, se for mais longo o tempo de transporte não pode ser evitada, o transporte, a 4 ° C em solução oxigenada pode ser vantajosa. 1. Prearrangements Ligue o thermocirculator, que controla a temperatura do recipiente encamisado (Tabela II). Certifique-se de que a temperatura dentro do recipiente é igual a 37 ° C. Cobrir a proveta com uma tampa de vidro para manter uma temperatura constante no interior da taça ao longo de todo o processo de isolamento. Pesa-se a colagenase I e protease XXIV em três copos de vidro e armazená-lo a temperatura ambiente. As enzimas serão diluídos imediatamente antes da utilização. Loja 20 ml de uma solução de Ca2 + livre numa placa de Petri, a 4 ° C. Loja 250 ml de Ca2 + livre em solução num banho de água a 37 ° C. 2. Limpeza do Tecido Transfira a amostra de tecido em conjunto com a solução de transporte numa placa de Petri (~ 10 cm de diâmetro) e remover o tecido adiposo aproximadamente usando uma tesoura. Pesa-se a amostra de tecido. Entre 200 e 600 mg são utilizados para isolamento de células. O tecido restante pode ser congelada em azoto líquido para posterior análise bioquímica. Transfira a amostra de tecido para a placa de Petri contendo 20 ml de uma solução de Ca2 + livre, a 4 ° C (ver passo 1.3) e cortar a amostra de tecido em pequenos pedaços de aproximadamente 1 mm 3 de tamanho. Os passos seguintes devem ser executadas a 37 ° C e sob gaseificação contínua com 100% de O 2. Uma ponta de pipeta pode ser colocado no tubo de oxigénio para evitar a forte ebulição e gerar um fluxo de ar contínuo. Transfira os pedaços de tecido juntamente com a solução de 2 Ca + livre emao béquer com camisa e agitou-se cuidadosamente durante cerca de 3 min, com uma barra de agitação magnética. Pare de mexer e deixe os pedaços de tecido para se acalmar por alguns segundos. Estirpe cuidadosamente o sobrenadante através de uma malha de nylon (200 um, Tabela II). Retorne os pedaços de tecido contido da malha no copo usando uma pinça. Encher o copo com Ca 2 + solução gratuita e repita a etapa de lavagem 2.4 e 2.5, duas vezes. 3. Primeiro digestão enzimática Re-suspender os pedaços de tecidos com 20 ml de solução de enzima E1 (Quadro I) contendo colagenase e protease e agita-se cuidadosamente durante 10 min. Adicionar 40 ul de 10 mM de CaCl 2-solução para obter uma concentração final de 20 mM de Ca 2 +. Após 35 min coe o sobrenadante cuidadosamente através de uma malha de nylon (200 um, Tabela II) de uma maneira que a maioria dos pedaços de tecido permanecem no copo. Resto retornarchover pedaços de tecido a partir da malha para o copo. 4. Segundo digestão enzimática Ressuspender os pedaços de tecido de novo com 20 ml de solução de enzima E2 colagenase I contendo apenas (Tabela I). Adicionar 40 ul de 10 mM de CaCl 2-solução imediatamente para se obter uma concentração final de 20 mM de Ca 2 +. Durante o segundo tesoura para cortar o uso de digestão mais coágulos tecido ocasionalmente. Após 5 min tomar uma amostra, utilizando uma pipeta de Pasteur, para procurar a dissociação de células. Repita isso a cada 2-3 min até em forma de bastonete, cardiomiócitos estriados aparecer. Pare de mexer e deixe os pedaços de tecido para estabelecer-se para cerca de 20-30 segundos. Coe o sobrenadante cuidadosamente através de uma malha de nylon (200 um, Tabela II) num tubo Falcon de 50 ml (um tubo). Retorne os pedaços de tecido contido da malha para o copo. Re-suspender os pedaços de tecido no copo com 20 ml storasolução ge (Tabela I) e após 10 dissociar as células por trituração mecânica suave usando uma pipeta de 20 ml serológica com doseador. Tente evitar a formação de bolhas, desde bolhas são prejudiciais para a sobrevivência e qualidade celular. Coe o sobrenadante cuidadosamente através de uma malha de nylon (200 mM, Tabela II) em um Falcon 50 ml (tubo B). 5. Preparação final e Ajuste de Final Ca 2 + Concentração Centrifugar os tubos Falcon ambos A e B (ver passo 4.5 e 4.7) a 95 xg durante 10 min. Remove-se o sobrenadante de ambos os tubos cuidadosamente por aspiração. Certifique-se de não perturbar o sedimento. Descartar o sobrenadante. Re-suspender em ambos os peletes de 1,5 ml de solução de armazenamento (Tabela I), cada uma (temperatura ambiente). Adicione duas vezes 7,5 mL de solução 10 mM CaCl 2 para cada Falcon e mexa com cuidado. Incubar durante 10 minutos depois de cada passo. Adicionar 15 ul de solução de CaCl2 10 mM para se obter uma última concentração de Ca2 + de 0,2 mM. 6. O carregamento dos miócitos com o fluorescente de Ca 2 + Fluo-indicador-3 AM (Figura 1) Transferir 1,5 ml de suspensão de células (tubo A e / ou o tubo B) para um tubo de microcentrifugação de 2 ml (tubo Eppendorf). Os seguintes passos devem ser executados tendo em consideração a sensibilidade à luz fluorescente do Ca 2 + Indicador de Fluo-3. Dissolve-se 50 mg do derivado do éster de acetoximetilo permeável membrana de Fluo-3 (Fluo-3 AM, Tabela III), em 44 mL do Pluronic F-127 (Tabela III), solução de reserva (20% w / v em DMSO anidro) para obter de 1 mm de Fluo-03:00 solução de stock, o que pode ser armazenada a -20 ° C durante, no máximo, de 1 semana. Adicionam-se 15 ul do Fluo-03:00 solução estoque para o tubo de microcentrífuga contendo 1,5 ml de suspensão de células (ver passo 6.1) e agitecuidado. Incubar a suspensão de células durante 10 minutos numa caixa opticamente opaca. Resumidamente, centrifugar a cerca de 6.000 rpm. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1,5 ml de solução de banho (Tabela IV). Deixe a suspensão celular por cerca de 30 min para de-esterificação, antes de iniciar os experimentos. 7. Simultâneas de patch-clamp e epifluorescência Ca 2 + Medições Desde que as medições de patch-clamp não são o principal tema desta revisão, referem-se ao leitor interessado em outras publicações fornecendo uma descrição mais aprofundada desta técnica. 11-14 Por uma questão de exaustividade nós fornecemos um breve resumo de um protocolo para medir potenciais de ação ou L-tipo Ca 2 + correntes, ambos com gravações simultâneas Ca 2 +-transitória. Durante as experiências de miócitos são superfused a 37 ° C com banho de solução quena (Tabela IV), utilizando um sistema de perfusão rápida (Octaflow IITM, ALA Scientific Instruments, NY). Para as experiências de tensão-grampo, as correntes de K + são bloqueados pela adição de 4-aminopiridina (5 mmol / L) e BaCl 2 (0,1 mmol / L) à solução de banho. Microeléctrodos de vidro de borosilicato e são utilizados devem ter resistências de ponta de 2-5 mohms quando cheio com a solução da pipeta (Tabela V). Além do Fluo-3 AM carregando dos miócitos (ver passo 6), Fluo-3 também está incluído na solução de pipeta (Tabela V). Fluorescência está animado a 488 nm e luz emitida (<520 nm) convertido em [Ca 2 +] i assumindo d, em que k = constante de dissociação de Fluo-3 (864 nM), F = fluorescência de Fluo-3,. Fmax = fluorescência de Ca2 +-saturada obtida no final de cada experiência de 12 Ambos os sinais eléctricos e Ca 2 + sinais epifluorescência são gravados simultaneamente. Os potenciais de ação são estimulados a 0,5 Hz no modo atual-clamp usando um ms pulsos de corrente de força limiar 1.2x. Tipo-L de Ca 2 +-correntes são medidas no modo de voltagem-grampo com um potencial de manutenção de -80 mV e 100 mseg de rampa de pulso para -40 mV para inactivar o jejum de Na +-corrente, seguido por uma de 100 mseg ensaio de pulso para 10 mV a 0,5 Hz.