Isolamento dei miociti atriali umane per misure simultanee di Ca^{2 +} Transitori e correnti di membrana

Protocolli sperimentali devono essere approvati dal comitato etico locale e tutti i pazienti hanno bisogno di dare un consenso informato scritto. La nostra ricerca è stato approvato dal Comitato Etico della Facoltà di Medicina di Mannheim, Università di Heidelberg (# 2011-216n-MA) ed è stata eseguita in conformità a tutte le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano. Tutti i pazienti hanno dato consenso informato scritto. 0. Ottenere umana tessuto atriale Durante le procedure di incannulazione routine in pazienti sottoposti a chirurgia a cuore aperto per bypass cardiopolmonare innesto la punta del diritto appendice atriale è solitamente rimosso e può essere utilizzato per l'isolamento di cardiomiociti atriali. Dopo l'asportazione del campione di tessuto viene trasferito immediatamente in un tubo da 50 ml Falcon con sterile Ca 2 + senza soluzione di trasporto contenente 2,3-butanedione monoxime (tabella I, BDM, inibitore contrattile, impedendo miociti contracture). Con i tempi di trasporto tra i 30 ei 45 minuti, non abbiamo riconosciamo un chiaro vantaggio di raffreddamento o di ossigenazione per quanto riguarda sia il numero e la qualità dei isolate cardiomiociti atriali. In generale, il trasporto al laboratorio deve essere il più velocemente possibile. Tuttavia, se tragitto lungo, non può essere evitato, trasporto a 4 ° C in soluzione ossigenata potrebbe essere vantaggiosa. 1. Predisposizioni Accendere il thermocirculator, che controlla la temperatura del becher incamiciata (Tabella II). Assicurarsi che la temperatura all'interno del bicchiere equivale a 37 ° C. Coprire il becher con un coperchio di vetro per mantenere una temperatura costante all'interno del becher in tutto il processo di isolamento. Pesare il Collagenasi I e proteasi XXIV in tre bicchieri di vetro e conservarla a temperatura ambiente. Gli enzimi saranno diluiti prima dell'uso. Conservare 20 ml di Ca 2 + soluzione gratuita in una capsula di Petri a 4 ° C. Negozio 250 ml di Ca 2 + soluzione libera in un bagno d'acqua a 37 ° C. 2. Pulizia del Tissue Trasferire il campione di tessuto insieme alla soluzione di trasporto in una capsula Petri (~ 10 cm di diametro) e rimuovere il tessuto adiposo all'incirca usando forbici. Pesare il campione di tessuto. Tra 200 e 600 mg sono utilizzati per l'isolamento delle cellule. Il restante tessuto può essere congelato in azoto liquido per la successiva analisi biochimica. Trasferire il campione di tessuto nella capsula di Petri contenente 20 ml di Ca 2 + soluzione a 4 ° C (vedi punto 1.3) e tritare il campione di tessuto in piccoli pezzi di circa 1 mm 3 di dimensione. Le seguenti operazioni devono essere eseguite a 37 ° C e sotto la continua emissione di gas con il 100% O 2. Una punta di pipetta può essere posizionato sul tubo ossigeno ad evitare forti bubbling e generare il flusso d'aria continuo. Trasferire i pezzi di tessuto insieme alla soluzione 2 +-libero in Caper il bicchiere con guaina e mescolate con cura per circa 3 minuti con un agitatore magnetico. Smettere di mescolare e lasciare i pezzi di tessuto di stabilirsi per qualche secondo. Colare attenzione il surnatante con una rete di nylon (200 micron, tabella II). Restituire i pezzi di tessuto trattenuto dalla maglia nel bicchiere con pinze. Riempire il bicchiere con Ca 2 + soluzione gratuita e ripetere la fase di lavaggio 2.4 e 2.5 due volte. 3. Prima digestione enzimatica Risospendere i pezzi di tessuto con 20 ml di soluzione enzimatica E1 (Tabella I) contenente collagenasi e proteasi e mescolate con cura per 10 min. Aggiungere 40 ml di 10 mM CaCl 2-soluzione per ottenere una concentrazione finale di 20 mM Ca 2 +. Dopo 35 min forzerebbe il surnatante con cura attraverso una maglia di nylon (200 micron, tabella II) in un modo che la maggior parte dei pezzi di tessuto rimangono nel becher. Resto Ritornopiovuto pezzi di tessuto dalla maglia nel bicchiere. 4. Seconda digestione enzimatica Sospendere di nuovo i pezzi di tessuto con 20 ml di soluzione di enzima E2 contenente collagenasi ho solo (Tabella I). Aggiungere 40 ml di 10 mM CaCl 2-soluzione immediata per ottenere una concentrazione finale di 20 mM Ca 2 +. Durante il secondo uso forbici digestione di tagliare ulteriormente i coaguli di tessuto di tanto in tanto. Dopo 5 min prendere un campione con una pipetta Pasteur controlla la dissociazione delle cellule. Ripetere questa operazione ogni 2-3 minuti fino a quando appaiono a forma di bastoncello, cardiomiociti striati. Smettere di mescolare e lasciare i pezzi di tessuto di stabilirsi per circa 20-30 sec. Filtrare il surnatante con cura attraverso una rete di nylon (200 micron, tabella II) in una provetta da 50 ml Falcon (metro A). Restituire i pezzi di tessuto trattenuto dalla maglia nel bicchiere. Risospendere i pezzi di tessuto nel bicchiere con 20 ml Storage soluzione (Tabella I) 10 e di dissociare ulteriormente le cellule dolce triturazione meccanica utilizzando un 20 ml pipetta sierologica con dispenser. Cercate di evitare la formazione di bolle in quanto le bolle sono dannose per la sopravvivenza delle cellule e di qualità. Filtrare il surnatante con cura attraverso una rete di nylon (200 micron, la tabella II) in un tubo ml Falcon 50 (metro B). 5. Preparazione finale e regolazione di Finale Ca 2 + Concentrazione Centrifugare sia Falcon tubi A e B (vedi punto 4.5 e 4.7) a 95 g per 10 min. Rimuovere il surnatante da entrambi i tubi con attenzione per aspirazione. Fare attenzione a non disturbare il pellet. Scartare il surnatante. Risospendere pellet in entrambe le soluzione di storage da 1,5 ml (Tabella I) ogni (temperatura ambiente). Aggiungere due volte 7,5 ml di 10 mM CaCl 2 soluzione per ogni Falcon e mescolate con cura. Incubare per 10 minuti dopo ogni passaggio. Aggiungere 15 ml di 10 mM di soluzione di CaCl 2 per ottenere una finale Ca 2 + concentrazione di 0,2 mM. 6. Caricamento dei miociti con lo fluorescente Ca 2 +-Indicatore Fluo-3 AM (Figura 1) Trasferire 1,5 ml di sospensione cellulare (tubo A e / o il tubo B) in una provetta per microcentrifuga da 2 ml (provetta Eppendorf). Le seguenti operazioni devono essere eseguite e considerando la sensibilità alla luce del Ca 2 + indicatore fluorescente Fluo-3. Sciogliere 50 mg della membrana permeabile derivato estere acetossimetilico di Fluo-3 (Fluo-3 AM, Tabella III) in 44 microlitri della Pluronic F-127 (Tabella III) soluzione madre (20% w / v in DMSO anidro) per ottenere ± 1 mm Fluo-03:00 soluzione madre, che può essere conservato a -20 ° C per un massimo di 1 settimana. Aggiungere 15 microlitri della Fluo-03:00 soluzione madre alla provetta contenente 1,5 ml di sospensione cellulare (vedi punto 6.1) e agitareattentamente. Incubare la sospensione cellulare per 10 min in una scatola otticamente opaca. Centrifugare brevemente a circa 6.000 giri al minuto. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 1,5 ml di soluzione del bagno (Tabella IV). Lasciare la sospensione cellulare per circa 30 min per de-esterificazione prima di iniziare con gli esperimenti. 7. Simultanei patch-clamp e epifluorescente Ca 2 + Misure Dal momento che le misurazioni di patch-clamp non sono l'argomento principale di questa recensione, rimandiamo il lettore interessato ad altre pubblicazioni che forniscono una descrizione più approfondita di questa tecnica. 11-14 Per completezza forniamo una breve sintesi di un protocollo per misurare potenziali d'azione o di tipo L Ca 2 + correnti, entrambi con simultanei Ca 2 +-registrazioni transitori. Durante gli esperimenti miociti sono superfuse a 37 ° C con bagno solutisu (tabella IV) utilizzando un sistema di perfusione rapido (Octaflow IITM, ALA Scientific Instruments, NY). Per gli esperimenti di tensione-clamp, K + correnti vengono bloccati aggiungendo 4-aminopiridina (5 mmol / L) e BaCl 2 (0,1 mmol / L) alla soluzione del bagno. Microelettrodi di vetro borosilicato sono utilizzati e dovrebbero avere la mancia resistenze di 2-5 MW, quando riempita con pipetta soluzione (Tabella V). Oltre al Fluo-03:00 caricando dei miociti (vedere fase 6), Fluo-3 è anche incluso nella soluzione pipetta (Tabella V). Fluorescenza è eccitato a 488 nm e la luce emessa (<520 nm) convertito [Ca 2 +] i supponendo dove k d = costante di dissociazione di Fluo-3 (n 864M), F = Fluo-3 fluorescenza. F max = Ca 2 +-fluorescenza saturo ottenuto al termine di ogni esperimento 12 Entrambi i segnali elettrici e epifluorescente Ca 2 + segnali vengono registrate contemporaneamente. I potenziali d'azione sono stimolate a 0,5 Hz in modalità current-clamp con 1 msec attuali impulsi di forza soglia 1.2x. L-tipo Ca 2 +-correnti sono misurati in modalità voltage-clamp utilizzando un potenziale di mantenimento di -80 mV e 100 msec-ramp-impulso a -40 mV per inattivare la rapida Na +-corrente, seguito da un 100-msec test-impulso a +10 mV a 0,5 Hz.