Isolation des myocytes auriculaires humaines pour la mesure simultanée de Ca^{2 +} Transitoires et courants membranaires

Les protocoles expérimentaux doivent être approuvés par le comité d'éthique local et tous les patients ont besoin de donner un consentement éclairé écrit. Notre recherche a été approuvé par le comité d'éthique de la Faculté de médecine de Mannheim, Université de Heidelberg (# 2011-216N-MA) et a été réalisée en conformité avec toutes les directives institutionnelles, nationales et internationales pour le bien-être humain. Tous les patients ont donné leur consentement éclairé. 0. L'obtention de tissu auriculaire humain Pendant les procédures de cathétérisme routine chez les patients subissant une chirurgie à coeur ouvert pour la circulation extracorporelle greffe, la pointe de l'appendice auriculaire droit est habituellement retiré et peut être utilisé pour l'isolement des cardiomyocytes auriculaires. Après l'excision de l'échantillon de tissu est transféré immédiatement dans un tube Falcon de 50 ml avec du Ca 2 + libre stérile solution de transport contenant la 2,3-butanedione monoxime (tableau I; BDM, inhibiteur contractile, ce qui empêche des myocytes contracture). Avec des temps de transport entre 30 et 45 min, nous n'avons pas reconnu un net avantage de refroidissement ou d'oxygénation par rapport à la fois le nombre et la qualité des cardiomyocytes auriculaires isolées. Dans les transports en général au laboratoire doit être aussi rapide que possible. Toutefois, si le temps de transport plus ne peut être évitée, transport à 4 ° C dans une solution oxygénée pourrait être avantageux. 1. Préarrangements Allumez le thermocirculator, qui contrôle la température du récipient à double enveloppe (tableau II). Assurez-vous que la température dans le bécher est égal à 37 ° C. Recouvrir d'un couvercle en verre pour maintenir une température constante à l'intérieur du récipient à travers le processus d'isolement ensemble. Peser la collagénase I et protéase XXIV dans trois récipients en verre et stocker à température ambiante. Les enzymes seront dilués juste avant utilisation. Magasin 20 ml de Ca 2 + solution libre dans une boîte de Petri à 4 ° C. Magasin 250 ml de solution de Ca 2 + libre dans un bain d'eau à 37 ° C. 2. Nettoyage du tissu Transférer l'échantillon de tissu avec la solution de transport dans une boîte de Pétri (~ 10 cm de diamètre) et enlever les tissus adipeux grossièrement avec des ciseaux. Peser l'échantillon de tissu. Entre 200 et 600 mg sont utilisés pour l'isolement de cellules. Le tissu restant peut être congelé dans l'azote liquide pour une analyse ultérieure biochimique. Transférer l'échantillon de tissu dans la boîte de Petri contenant 20 ml de Ca 2 + solution à 4 ° C (voir l'étape 1.3) et hacher l'échantillon de tissu en petits morceaux d'environ 1 mm 3 dans la taille. Les étapes suivantes doivent être exécutées à 37 ° C et sous gazage continu avec 100% d'O 2. Un embout de pipette peut être placé sur le tube d'oxygène pour éviter la formation de bulles et de forte générer un flux d'air continu. Transférer les morceaux de tissu avec la solution sans Ca + 2 endans le bécher enveloppe et mélangez soigneusement pendant environ 3 min avec un agitateur magnétique. Arrêtez de remuer et laisser les morceaux de tissus à s'installer pendant quelques secondes. Filtrer soigneusement le surnageant à l'aide d'un filet de nylon (200 um, tableau II). Remettre les morceaux de tissus sobres du maillage dans le bécher aide d'une pince. Remplir le bécher avec Ca 2 + solution libre et répéter l'étape de lavage 2.4 et 2.5 deux fois. 3. Première digestion enzymatique Re-suspendre les morceaux de tissus avec 20 ml Enzyme solution E1 (tableau I) contenant de la collagénase et la protéase et mélangez soigneusement pendant 10 min. Ajouter 40 ul de 10 mM de CaCl2 solution pour obtenir une concentration finale de 20 uM Ca 2 +. Après filtrer le surnageant 35 min soigneusement à travers un tamis en nylon (200 um, Tableau II) de façon que la majeure partie des morceaux de tissu restent dans le bécher. Retour reposplu morceaux de tissus provenant de la maille dans le bécher. 4. Deuxième digestion enzymatique Reprendre les morceaux de tissus de nouveau avec 20 ml enzyme E2 solution contenant de la collagénase I seulement (tableau I). Ajouter 40 ul de 10 mM de CaCl2 solution immédiatement pour obtenir une concentration finale de 20 uM Ca 2 +. Au cours de la deuxième utilisation des ciseaux de digestion de couper davantage caillots de tissus parfois. Après 5 minutes, prendre un échantillon à l'aide d'une pipette Pasteur pour vérifier la dissociation des cellules. Répétez cette opération tous les 2-3 min jusqu'à ce que la tige en forme de cardiomyocytes striés apparaissent. Arrêtez de remuer et laisser les morceaux de tissus à s'installer pendant environ 20-30 secondes. Filtrer le surnageant soigneusement à travers une maille de nylon (200 um, Tableau II) dans un tube de 50 ml Falcon (Tube A). Remettre les morceaux de tissus sobres du maillage dans le bécher. Re-suspendre les morceaux de tissus dans le bécher avec 20 ml Storasolution GE (tableau I) 10 et plus dissocier les cellules par trituration mécanique douce à l'aide d'une pipette sérologique de 20 ml avec distributeur. Essayez d'éviter la formation de bulles depuis bulles sont préjudiciables à la survie et la qualité cellulaire. Filtrer le surnageant soigneusement à travers une maille de nylon (200 um, tableau II) dans un ml Tube Falcon 50 (tube B). 5. Préparation finale et d'adaptation de Final concentration de Ca2 + Centrifugeuse deux Falcon tubes A et B (voir l'étape 4.5 et 4.7) à 95 g pendant 10 min. Eliminer le surnageant de deux tubes soigneusement par aspiration. Assurez-vous de ne pas perturber le culot. Jeter le surnageant. Re-suspendre les boulettes dans une solution de stockage de 1,5 ml (tableau I) chacune (température ambiante). Ajoutez deux fois 7,5 pi de solution à 10 mM CaCl2 à chaque Falcon et mélangez soigneusement. Incuber pendant 10 minutes après chaque étape. Ajouter 15 ul d'une solution à 10 mM CaCl 2 pour obtenir une finale Ca 2 + concentration de 0,2 mM. 6. Chargement des myocytes avec le Ca 2 + Fluorescent indicateur Fluo-3 AM (Figure 1) Transférer 1,5 ml de suspension cellulaire (tube A et / ou du tube B) dans un microtube de 2 ml (tube Eppendorf). Les étapes suivantes doivent être exécutées à l'étude de la sensibilité à la lumière du Ca 2 + indicateur fluorescent Fluo-3. Dissoudre 50 mg du dérivé d'ester acétoxyméthylique perméable de la membrane de Fluo-3 (Fluo-3 AM, Tableau III) dans 44 pl de la Pluronic F-127 (tableau III) solution (20% p / v dans du DMSO anhydre) pour obtenir ± 1 mm Fluo-3 heures solution mère, qui peut être conservé à -20 ° C pendant au maximum 1 semaine. Ajouter 15 ul du Fluo-3 heures solution stock à la microtube contenant 1,5 ml de suspension cellulaire (voir l'étape 6.1) et agitersoigneusement. Incuber la suspension de cellules pendant 10 min dans une boîte optiquement opaque. Centrifuger brièvement à environ 6000 rpm. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans une solution de bain de 1,5 ml (Tableau IV). Laisser la suspension cellulaire pendant environ 30 min pour désestérification avant le début des expériences. 7. Simultanés patch-clamp et épifluorescence Ca 2 + Mesures Puisque les mesures de patch-clamp sont pas le sujet principal de cette étude, nous renvoyons le lecteur intéressé à d'autres publications fournissant une description plus détaillée de cette technique. 11-14 Par souci d'exhaustivité, nous donnons un bref résumé d'un protocole pour mesurer potentiels d'action ou de courants Ca 2 + de type L, les deux avec 2 enregistrements +-transitoires simultanées ca. Au cours d'expériences myocytes sont perfusées à 37 ° C avec baignoire solutisur (Tableau IV) en utilisant un système de perfusion rapide (Octaflow IITM, ALA Scientific Instruments, NY). Pour les expériences de potentiel imposé, courants K + sont bloquée par addition de 4-aminopyridine (5 mmol / L) et de BaCl 2 (0,1 mmol / L) à la solution du bain. Microélectrodes de verre borosilicate sont utilisés et auraient dû faire pencher résistances de 2-5 MQ quand il est rempli avec une solution pipette (Tableau V). En plus du Fluo-3 heures Chargement de la myocytes (voir l'étape 6), Fluo-3 est également inclus dans la solution pipette (Tableau V). La fluorescence est excitée à 488 nm et la lumière émise (<520 nm) converti en [Ca 2 +] i en supposant où k d = constante de dissociation de Fluo-3 (864 nM), F = Fluo-3 fluorescence;. Fmax = Ca2 +-fluorescence saturée obtenue à la fin de chaque expérience 12 Les deux signaux électriques et épifluorescence Ca 2 + signaux sont enregistrés simultanément. Les potentiels d'action sont stimulés à 0,5 Hz en mode courant-clamp avec 1 ms impulsions de courant de la force de seuil 1.2x. De type L de Ca 2 +-courants sont mesurés en mode voltage-clamp à l'aide d'un potentiel de maintien de -80 mV et une de 100 msec rampe impulsion à -40 mV à inactiver la Na +-courant rapide, suivie d'une 100 msec test d'impulsion de 10 mV à 0,5 Hz.