Nous présentons ici une méthode histologique pour la capture, l'étiquetage, la compensation optique et l'imagerie de l'interface cerveau intact tissu autour de microdispositifs chroniquement implantés dans le tissu cérébral des rongeurs. Les résultats des techniques comprenant cette méthode sont utiles pour comprendre l'impact des différentes pénétrantes cérébrales implants sur leur tissu environnant.
Les recherches sur la conception et l'utilisation de microsystèmes cerveau implantés, tels que réseaux de microélectrodes, vise à produire des dispositifs cliniquement pertinentes qui s'interfacent avec les tissus environnants chronique du cerveau. Tissu entourant ces implants est pensé à réagir à la présence des dispositifs au cours du temps, ce qui comprend la formation d'un isolant "cicatrice gliale" autour des dispositifs. Cependant, l'analyse histologique de ces changements dans les tissus est généralement effectuée après explantation du dispositif, dans un processus qui peut perturber la morphologie du tissu d'intérêt.
Ici nous démontrons un protocole dans lequel corticales implantés les appareils sont recueillis intact dans les tissus environnants cerveau des rongeurs. Nous décrivons comment, une fois perfusé avec un fixateur, les cerveaux sont retirés et tranchés de manière à éviter les appareils explantation. Nous soulignons l'étiquetage des anticorps fluorescents et les méthodes de compensation optiques utiles pour la production d'une information, les tissus épais encoresection. Enfin, nous démontrons que le montage et l'imagerie de ces coupes de tissus afin d'enquêter sur l'interface biologique autour du cerveau implantés appareils.
Le domaine de neuroprothèses recherche vise à aider les personnes souffrant de divers handicaps et de troubles en court-circuitant les structures malades ou endommagés dans le corps par le biais du système nerveux central interfaçage 1,2 appareils. Microdispositifs Brain-implantés, tels que réseaux de microélectrodes (MEA), peut être utilisé pour enregistrer ou stimuler des structures cérébrales, et permettre ainsi la mise en place d'interfaces à long terme entre l'électronique et le tissu du SNC 3-5. AME pénétrantes, des dispositifs qui sont enfoncés dans le tissu cérébral, particulièrement prometteuses comme des interfaces bidirectionnelles en raison de la proximité étroite au sein de laquelle ils présentent électrodes à un ensemble relativement restreint de neurones voisins 6.
Toutefois, le tissu complexe des réponses résultent de l'implantation à long terme de ces accords pénétrants, ce qui entraîne souvent variables et peu à peu dégradant électrophysiologiques signal sur bruit plus de jours à plusieurs mois, et une augmentation impédance électriqueéquilibre entre sites d'électrodes et la masse 7,8. Les origines supposées de ces changements comprennent l'activation de la microglie, astrocytose réactive le long des microsystèmes, et une perte ou la migration des neurones du tissu environnant aux dispositifs implantés 9-11. Un défi majeur pour la compréhension de ces changements dans les tissus autour de chroniques AME pénétration, est la difficulté à saisir les données histologiques de l'interface tissu intact autour de dispositifs implantés chroniquement 12. L'analyse histologique du tissu avec l'interface de périphérique / tissu toujours présent serait améliorer les actuels dispositif d'enlèvement des protocoles histologiques. Avec un dispositif intact restant dans le tissu, l'impact biologique des interactions relativement subtiles, telles que l'utilisation de revêtements biocompatibles 13,14 ou compensation électrique de la surface d'électrode 15,16, pourraient être numérisés et analysés par rapport à l'implant.
Havant nous démontrons une méthode de collecte, de traitement, et l'image de l'interface microdispositif intact pour la microscopie détaillée basée sur l'analyse du tissu cérébral environnant. Dans ce procédé, le dispositif et le tissu cérébral environnant sont recueillies dans une coupe de tissu (> 250 pm) d'épaisseur en utilisant un vibratome. Pour améliorer la pénétration des marques histologique dans ces tranches épaisses, étiquettes fluorescentes histochimiques et immunohistochimiques sont appliquées à des concentrations élevées dans des solutions contenant du sérum bloquant et détergent pendant plusieurs jours. Une solution de compensation optique est utilisée pour améliorer la profondeur d'imagerie de microscopie, et le tissu est monté en face des chambres 2-laser pour la suite microscopie confocale à balayage 17. À capturer l'interface complète histologique, une étape commandée par ordinateur de translation est utilisé lors de l'imagerie de recueillir z-pile panoramas le long de la longueur des implants. En plus de l'imagerie appliquée étiquettes tissus, la collecte de réflectance laser retour des implantset la transmission de lumière à travers le tissu à la fois permettre la localisation de l'interface de dispositif par rapport aux tissus environnants. Tissus préparés en utilisant ce "Device-Capture Histologie" (DCHist) protocole d'imagerie permet d'accéder aux morphologiquement préservé tissus / dispositif interactions, et améliore ainsi sur précédentes dispositif d'enlèvement des protocoles histologiques 18.
Le "Device-Capture Histologie" (DCHist) méthode décrite ici permet l'évaluation histologique de près les interactions entre morphologiquement préservé tissus du cerveau et les implants tissulaires. Collecte de tissus DCHist nécessite une séparation minutieuse des composants de l'appareil crâne montés à partir de composants implantés dans le cerveau. DCHist nécessite également la collecte d'une tranche histologique épais (> 250 m). Ces coupes de tissus, une fois étiqueté, effacé, monté et imagé, peut fournir des indications nouvelles sur la blessure d'implantation ou ultérieure réponse chronique à des dispositifs à demeure. Utilisation des outils de microscopie de pointe, l'interface entre le tissu et le dispositif peuvent être visualisés et analysés en détails élevés, comme indiqué dans les figures 3-5.
Les techniques présentées dans leur forme actuelle repose sur la capacité à creuser l'écart lentement la coiffe fabriqué à partir de ciment dentaire en deux parties et Kwik-Sil jusqu'au point d'implantation du dispositif.L'utilisation de ciment dentaire qui peut être brûlé ou autrement retirée et un élastomère de silicone clair à travers lequel de petits ciseaux peut être guidé visuellement grandement aider à réussir à séparer le dispositif implanté crâne de ses composants montés. Tenter de couper l'appareil sous le crâne et surtout le cerveau afin de le récupérer in situ n'est pas recommandée, car l'implant crâne monté sera sorti du cerveau d'un montant significatif.
Bien plus minces, les implants plus petits, tels que les AEM tige unique de technologies NeuroNexus, sont plus propices à DCHist, les principes ne se limitent pas à tiges simples ou périphériques réseaux de microélectrodes. Collecte et stratégies d'imagerie sont largement applicables à tiges multiples dispositifs et implants plus grands tels que les canules, les conditions étant qu'ils doivent être séparés de toute monture crâne et recueillies dans une coupe de tissu épais. Bien que les auteurs se concentrent sur l'analyse des tissusentourant les implants corticaux, dispositifs entraînés profondément dans le cerveau pourrait également être collectées et imagée. La profondeur de pose de l'implant ne devrait pas affecter la capture de l'implant dans une tranche à condition que le dispositif ne s'écarte pas de manière extravagante de l'angle connu d'insertion.
Limitations existent à l'application utile de la méthode DCHist. Coupes de tissus du cerveau sont difficiles à l'image à travers des centaines de micromètres, en particulier dans les domaines de la substance blanche, bien que des solutions de compensation optique peut grandement améliorer la profondeur d'imagerie dans différents tissus 21. Pour améliorer encore la profondeur d'imagerie, la microscopie à deux photons d'excitation peut être utilisé en même temps que la compensation optique décrit.
Une autre limitation potentielle de la méthode décrite peut être des méthodes spécifiques et des anticorps fluorescents immunohistochimie employées par les chercheurs. La diffusion passive entraîne généralement la prise en compte de ces marqueurs dans les tissus fixeet sur les sites de liaison d'antigène. Les concentrations finales de travail anticorps doit être déterminée par des chercheurs au cas par cas afin de maximiser la pénétration des marques, tout en évitant des niveaux élevés d'étiquetage arrière-plan. Marquage de l'anticorps ne doit pas être variable entre les tranches qui sont traitées de manière identique, mais les anticorps différents peuvent varier considérablement dans leur capacité à pénétrer et à marquer leur antigène, avec certains anticorps facilement l'étiquetage des antigènes de plusieurs centaines de micromètres de profondeur et d'autres antigènes d'étiquetage seulement quelques dizaines de micromètres de profondeur. Nous décrivons l'amélioration de cette diffusion par l'application d'étiquettes d'anticorps à un niveau supérieur concentrations typiques, pendant plusieurs jours d'application, et dans une solution contenant un détergent dilué et sérum bloquant. Périodiquement, renversant les tranches favorise également la même étiquetage. Étapes d'extraction des antigènes et des processus de fixation de remplacement (par exemple le glutaraldéhyde, micro-ondes, etc) peut être approprié pour des antigènes spécifiques. Anticorps secondaire-fluorochrome conjugués peuvent également varier dans leur performance marquage des coupes épaisses, même si cela n'a pas été observé par les auteurs à l'aide Alexa Fluor étiquettes d'Invitrogen. Alternativement, les sujets animaux transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dans les types cellulaires d'intérêt peuvent être utilisés pour éviter les problèmes avec la pénétration des marques d'anticorps, comme de nombreuses protéines fluorescentes, comme eGFP, conservent leur fluorescence après traitement au formaldéhyde, et peuvent être immédiatement visualisées dans des coupes de tissus.
DCHist est un puissant ensemble de techniques pour recueillir et analyser l'impact de microsystèmes implantés sur le tissu cérébral. Couplage avec le protocole histologique évaluation in vivo de la qualité de l'électrophysiologie et de l'impédance des électrodes 22 pourraient grandement améliorer notre compréhension des sources biologiques de la variabilité physiologie et de la dégradation. Le domaine de prothèses neurales implantées en particulier peuvent bénéficier de la fiche détaillée ima DCHistGing de l'appareil intact / tissus d'interface pour informer le développement de dispositifs AME biologiquement neutres.
The authors have nothing to disclose.
Toutes les expériences ont été effectuées sous la supervision de la protection des animaux et le Comité de Purdue utilisation et le Programme relatif aux animaux de laboratoire à l'Université Purdue.
Ce travail a été financé par la Defense Research Projects Agency avancée (DARPA) Microsystems Technology Office (MTO), sous les auspices du Dr Jack Judy W. (jack.judy @ darpa.mil) dans le cadre du programme de technologie Neural fiable, grâce à l'spatiale et navale Warfare Systems Command (SPAWAR) Systems Center (SSC) du Pacifique Grant n ° N66001-11-1-4013.
Les auteurs tiennent à remercier Mikhail Slipchenko, Don Ready, Greg Richter, Aaron Taylor, et Kevin Eliceiri pour partager leur expertise en microscopie.
Reagents | |||
Hoechst 33342 | Invitrogen | 14533 | DNA marker |
Rabbit anti-Iba1 | Wako (Japan) | 019-19741 | Monocyte antibody |
Dental acrylic | Lang Dental (various distributors) | Jet Denture Repair Powder & Liquid | Headcap construction |
Kwik-Sil | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Covering exposed cranial implants |
Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | Tissue processing |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | Tissue processing |
Urea | Sigma-Aldrich | U4883 | Clearing solution |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G20225 | Clearing solution |
Equipment | |||
Curved micro-scissors | World Precision Instruments | 14208 | Cutting implant before removing brain |
Razor blades | Ted Pella | (various sizes) | For use with Brain Block |
Acrylic Brain Matrice | Ted Pella | 15054 | Brain Block to create initial plane in tissue |
Plastic slides | Ted Pella | 260225 | Mounting tissue |
Cover glass | Ted Pella | (various sizes) | Mounting tissue |
Electrode arrays | NeuroNexus Technologies | (various designs) | Example MEAs |
Vibratome | Leica | VT1000 S | Specific system used in presented method |
Vibratome blades | (various suppliers) | Collecting slices | |
24-well plates | (various suppliers) | Storing and processing tissue slices | |
Confocal microscope with motorized XY-scanning stage | Carl Zeiss Microscopy | Zeiss LSM 710 and ‘Zen 2010’ software | Specific system used in presented method |
Soldering iron | (various suppliers) | Excavating headcap |