Здесь мы представляем гистологических методов для сбора, маркировки, оптически очистки и изображения нетронутый интерфейс мозговой ткани вокруг хронически имплантированными микроустройств в ткани головного мозга грызунов. Результаты от методов, включающий в себя этот метод полезны для понимания влияния различных проникающих мозг имплантанты на их окружающие ткани.
Исследования в области разработки и использования мозг имплантировали микроустройств, таких как массивы микроэлектродов, направлена на производство клинически значимых устройств, которые взаимодействуют с хроническими окружающие ткани. Ткани, окружающие эти имплантаты, как полагают, реагируют на присутствие устройства в течение долгого времени, которая включает в себя формирование изоляционного "глиальных рубцов" вокруг устройства. Тем не менее, гистологический анализ этих изменений тканей, как правило, производится после культивирующий в искусственной среде устройства, в процессе, который может привести к нарушению морфологии ткани интерес.
Здесь мы показываем протокол, в котором корково-имплантированных устройств собираются нетронутыми в окружающие ткани грызунов мозга. Мы опишем, как, когда перфузия фиксатором, мозг удаляют и нарезанные таким образом, чтобы избежать культивирующий в искусственной среде устройства. Мы выделяем флуоресцентные маркировки антител и оптические методы очистки полезен для создания информативной, но толстые тканираздел. Наконец, мы демонстрируем монтажа и обработки изображений этих срезов тканей для исследования биологических интерфейсов мозг вокруг имплантированных устройств.
Поле neuroprosthetic исследований направлена на оказание помощи лицам, страдающим от различных ограниченными возможностями и нарушениями в обход больных или поврежденных структур в организм через ЦНС взаимодействия устройств 1,2. Brain-имплантированных микроустройств, таких как массивы микроэлектродов (МПС), может быть использован для записи или стимулировать мозговые структуры, и таким образом позволяют установить долгосрочные интерфейсов между электроникой и ЦНС ткани 3-5. Проникающие МПС, устройства, которые приводятся в ткани головного мозга, занимать определенные надежды как двунаправленный интерфейс связи с непосредственной близостью, в которой они представят электродов относительно небольшой набор близлежащих нейронов 6.
Тем не менее, сложная ткань ответов результатом долгосрочной имплантации проникающего МПС, что часто приводит к переменным и постепенно унижающие электрофизиологических сигнал-шум в течение нескольких дней до нескольких месяцев, и увеличение электрического импедансаANCE между электродом сайтов и наземные 7,8. Предполагаемый происхождение этих изменений включают активацию микроглии, реактивные астроцитоз по микроустройств, и потеря или миграции нейронов из ткани, окружающие в имплантированных устройств 9-11. Одна из основных задач для понимания этих изменений тканей вокруг хронический, МПС проникновения трудности в захвате гистологические данные нетронутыми интерфейс тканей, окружающих хронически имплантированными устройствами 12. Гистологический анализ тканей с устройством / ткань интерфейс все еще присутствует бы улучшить текущее устройство удаления гистологического протоколов. С спокойно устройства, оставшиеся в тканях, биологическое воздействие сравнительно тонкие взаимодействия, такие, как использование биосовместимых покрытий 13,14 или электрической очистки поверхности электрода 15,16, могли бы быть отображены и проанализированы в связи с имплантатом.
Hпрежде чем мы демонстрируем метод для сбора, обработки, и изображение нетронутым интерфейс микроустройство для подробного микроскопии на основе анализа окружающие ткани головного мозга. В этом методе, устройство и окружающие ткани собираются в толстых (> 250 мкм) тканей секции, используя vibratome. Для улучшения гистологической проникновения метки в эти толстые ломтики, люминесцентные гистохимических и иммуногистохимических этикетки применяется при высокой концентрации в растворах, содержащих блокирование сыворотке крови и моющих средств за несколько дней. Оптическое решение очистки используется для улучшения глубины микроскопии изображений, и ткань устанавливается в 2-сторонней камеры для последующей лазерной сканирующей конфокальной микроскопии 17. Для получения полного гистологического интерфейс, управляемый компьютером поступательного этапе используется во время съемки для сбора Z-Stack панорамы по длине имплантата. В дополнение к визуализации применяются ткани этикетки, сбор лазерного отражения назад от имплантатови пропускание света через ткань, как помочь локализовать интерфейс устройства по отношению к окружающим тканям. Ткань подготовлены с использованием этой «Device-Capture Гистология" (DCHist) протокол обеспечивает изображение доступ к морфологически сохранившихся тканей / устройства взаимодействия, и таким образом улучшает предыдущее устройство удаления гистологического протоколов 18.
"Устройство-захват Гистология" (DCHist) метод позволяет продемонстрировали здесь близко гистологические оценки морфологически сохранившихся взаимодействия между мозговой ткани и ткани имплантаты. Коллекция тканей DCHist требует тщательного разделения черепа монтажа компонентов устройства от компонентов, имплантированных в мозг. DCHist также требует коллекция толстых гистологического среза ткани (> 250 мкм). Эти срезы ткани, когда-то помечены, очищено, установлены и отображаемого, может дать новые идеи в травме имплантации или последующего хронического ответ на пребывающего устройств. Используя передовые инструменты микроскопии, интерфейс между тканью и устройства могут быть выявлены и проанализированы в высокой детализации, как показано на рисунках 3-5.
Представленные методы в их нынешнем виде полагаться на способность медленно раскопки далеко headcap из двух частей стоматологического цемента и Kwik-Sil до точки имплантации устройства.Использование зубной цемент, который может быть сгорел или иным образом удалена и ясно эластомера кремния, через которую маленькие ножницы можно руководствоваться визуально значительно помочь в успешной отделения имплантированного устройства из его черепа монтажа компонентов. Попытка сократить устройство под черепом и выше мозга для того, чтобы собрать его на месте не рекомендуется, так как череп монтажа имплантатов будут выведены из мозга значительную сумму.
Несмотря на то, тоньше, меньше имплантатов, таких как одного МЭС хвостовик от NeuroNexus Technologies, наиболее пригодны для DCHist, принципы не ограничиваются одной черенки устройства или микроэлектрода массивов. Сбор и визуализация стратегии широко применимо к мульти-хвостовик устройств и больших имплантатов, таких как канюли, с требованиями том, что они должны быть отделены от любых черепа крепления и собранные в толстые раздела тканей. Хотя авторы сосредоточены на анализе тканейокружающей корковой имплантатов, устройств приводится глубже в мозг также может быть собрана и образ. Глубина установки имплантата не должно влиять на захват имплантата в кусочек условии, что устройство не отклоняются дико от известных угол введения.
Ограничения существуют для полезного применения DCHist метод. Срезы головного мозга ткани сложно изображения через сотни микрометров, особенно в районах с белым веществом, хотя и оптических решений очистки может значительно улучшить изображение глубинах в различных тканях 21. Для дальнейшего улучшения визуализации глубины, двухфотонного возбуждения микроскопия может быть использована вместе с оптического просветления описано.
Другим потенциальным ограничением описанный метод может быть конкретным флуоресцентные методы иммуногистохимии и антител, используемых исследователями. Пассивная диффузия обычно управляет включением этих маркеров через фиксированные ткании на сайты связывания антигена. Конечные концентрации рабочей антител должны быть определены исследователями на индивидуальной основе максимального проникновения этикетки, избегая при этом высокий уровень фона маркировки. Антитела маркировка не должна быть переменной между слоями, которые обрабатываются одинаково, но разные антитела могут значительно различаться по своей способности проникать и отметить их антигенов, антител с некоторыми антигенами легко маркировке многих сотен микрометров глубокие и другие маркировки антигенов всего несколько десятков микрометров глубины. Мы описываем улучшения этой диффузии с применением антител этикетки при более высоких концентрациях, чем обычные, за несколько дней применения, и в растворе, содержащем разбавленной моющим средством и блокирование сыворотки. Периодически листать ломтиками также способствует даже маркировки. Антиген поиска шаги и альтернативные процессы фиксации (например, глутаральдегида, микроволновая печь и т.д.) могут быть неподходящими для специфических антигенов. Вторичные антитела fluorochРим конъюгаты также могут варьироваться в их исполнении маркировки толстым слоем, хотя это не наблюдался авторами использовании Alexa Fluor этикетки от Invitrogen. Кроме того, трансгенные животные субъектов выразив флуоресцентных белков в клетке типов проценты могут быть использованы, чтобы избежать проблем с проникновением антитела этикетки, так как многие флуоресцентные белки, такие как EGFP, сохраняют свою флуоресценции после обработки формальдегидом, и может быть сразу же визуализируются в срезах тканей.
DCHist представляет собой мощный набор методов для захвата и анализа воздействия имплантированных микроустройств на ткани головного мозга. Соединение этой гистологической протокол с оценкой в естественных условиях электрофизиологии качества и сопротивление электрода данных 22 может значительно улучшить наше понимание биологических источников изменчивости физиологии и деградации. Области имплантированного нейронных протезов, в частности, могут извлечь выгоду из подробного DCHist IMAненности ВИЧ варьируется от неповрежденного устройства / ткань интерфейса сообщить дальнейшее развитие биологически нейтральными устройств МПС.
The authors have nothing to disclose.
Все эксперименты были проведены под руководством Уход Purdue животных и Комитетом по эксплуатации и программа лабораторных животных в Университете Пердью.
Эта работа была организована Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) Microsystems Technology Office (МТО), под эгидой доктора Jack W. Джуди (jack.judy @ darpa.mil) в рамках Программы Расписание нейронных технологий, через Космический центр и Naval Warfare Systems Command (SPAWAR) Системы (SSC) Тихоокеанского грант № N66001-11-1-4013.
Авторы хотели бы поблагодарить Михаила Слипченко, Don Ready, Грег Рихтера, Aaron Taylor, и Кевин Eliceiri для обмена опытом микроскопии.
Reagents | |||
Hoechst 33342 | Invitrogen | 14533 | DNA marker |
Rabbit anti-Iba1 | Wako (Japan) | 019-19741 | Monocyte antibody |
Dental acrylic | Lang Dental (various distributors) | Jet Denture Repair Powder & Liquid | Headcap construction |
Kwik-Sil | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Covering exposed cranial implants |
Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | Tissue processing |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | Tissue processing |
Urea | Sigma-Aldrich | U4883 | Clearing solution |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G20225 | Clearing solution |
Equipment | |||
Curved micro-scissors | World Precision Instruments | 14208 | Cutting implant before removing brain |
Razor blades | Ted Pella | (various sizes) | For use with Brain Block |
Acrylic Brain Matrice | Ted Pella | 15054 | Brain Block to create initial plane in tissue |
Plastic slides | Ted Pella | 260225 | Mounting tissue |
Cover glass | Ted Pella | (various sizes) | Mounting tissue |
Electrode arrays | NeuroNexus Technologies | (various designs) | Example MEAs |
Vibratome | Leica | VT1000 S | Specific system used in presented method |
Vibratome blades | (various suppliers) | Collecting slices | |
24-well plates | (various suppliers) | Storing and processing tissue slices | |
Confocal microscope with motorized XY-scanning stage | Carl Zeiss Microscopy | Zeiss LSM 710 and ‘Zen 2010’ software | Specific system used in presented method |
Soldering iron | (various suppliers) | Excavating headcap |