여기 광학 삭제하고, 쥐 뇌 조직에 만성 이식 microdevices 주변의 이미지 그대로 뇌 조직 인터페이스를 라벨, 캡처하기위한 조직 학적 방법을 제시한다. 이 방법을 포함하는 기술의 결과는 주변 조직의 다양한 관통 뇌 이식의 영향을 이해하는 데 유용합니다.
디자인 및 microelectrode 배열과 같은 뇌 이식 microdevices의 활용 연구는 뇌 조직을 둘러싼으로 만성 인터페이스 임상 관련 장치를 생산하는 것을 목표로하고 있습니다. 이러한 이식을 둘러싼 조직은 장치 주변의 절연 "glial 흉터"의 형성을 포함 시간이 지남에 따라 장치의 존재에 반응하는 것으로 생각된다. 그러나, 이러한 조직 변화의 조직 학적 분석은 일반적으로 관심의 조직의 형태를 방해 할 수있는 과정에서 장치를 explanting 후 수행됩니다.
여기 대뇌 피질 – 주입 장치가 쥐 뇌 세포를 둘러싼에 손상 수집되는 프로토콜을 보여줍니다. 우리는 한 번 정착액과 perfused 방법을 설명, 머리 제거 및 explanting 장치를 피하기 위해 같은 방법으로 썰어 있습니다. 우리는 형광 항체 라벨링 및 정보, 아직 두꺼운 조직을 생산하는 데 유용 광학 개간 방법을 설명절을 참조하십시오. 마지막으로, 우리는 뇌 이식 장치 주변의 생물 인터페이스를 조사하기 위해 이들 조직 섹션의 장착 및 이미징을 보여줍니다.
neuroprosthetic 연구 분야는 장치 1,2를 인터페이스 CNS를 통해 몸에 병에 걸린 또는 손상된 구조를 우회하여 다양한 장애 질환을 앓고있는 사람들을 지원하는 것을 목표로하고 있습니다. 이러한 microelectrode 배열 (MEAs)과 같은 뇌 이식 microdevices은, 기록 또는 자극 뇌 구조를, 그래서 전자와 CNS 조직 3-5 사이의 장기 인터페이스의 설립을 허용하는 데 사용할 수 있습니다. 관통 MEAs, 뇌 조직에 구동 장치는,이 근처 뉴런 6 상대적으로 작은 집합에 전극을 제시하는 이내에 가까이로 인해 양방향 인터페이스와 같은 특정 약속을 누르고 있습니다.
하지만, 관통 MEAs의 장기 이식에서 복잡한 조직 응답 결과는 종종 개월 일 동안의 변수를 점차적으로 저하 electrophysiological 신호 대 잡음 비율의 결과로, 전기 imped의 증가전극 사이트 및 지상 7,8 사이의 ance. 이러한 변화의 putative 기원은 microglia의 활성화, microdevices 따라 반응 astrocytosis 및 주입 장치 9-11에 주변 조직에서 뉴런의 손실이나 마이그레이션이 포함되어 있습니다. 만성, 침투 MEAs에있는 이런 조직 변화를 이해하는 데 큰 문제는 만성 이식 장치 12를 둘러싼 그대로 조직 인터페이스의 조직 학적 데이터를 캡처에 어려움이 있습니다. 여전히 현재 장치 / 조직 인터페이스를 조직의 조직 학적 분석은 현재의 장치 제거 조직 학적 프로토콜을 개선합니다. 조직에 남아 그대로 장치와 함께, 이러한 biocompatible 코팅 13,14 또는 전극 표면 15,16의 전기 개간의 활용 등 상대적으로 미묘한 상호 작용,의 생물학적 영향은 이미징 될 수 있고 임플란트에 대해 분석했다.
H오히려 우리는 수집하는 방법, 프로세스 및 이미지 주변 뇌 조직의 자세한 현미경 기반의 분석을 위해 그대로 microdevice 인터페이스를 보여줍니다. 이 방법에서, 장치 및 주변 뇌 조직은 vibratome를 사용하여 두께 (> 250 μm) 조직 섹션에 저장됩니다. 이 두꺼운 조각으로 조직 학적 라벨 침투을 개선하기 위해 형광등 histochemical 및 immunohistochemical 라벨은 여러 일 동안 차단 혈청 및 세제를 포함하는 솔루션에 높은 농도에 적용됩니다. 광학 개간 솔루션은 현미경 이미징 깊이를 개선하기 위해 고용하고 있으며, 조직은 공 촛점 현미경 17 스캔 이후 레이저를위한 양면 챔버에 장착되어 있습니다. 전체 조직 학적 인터페이스를 캡처하려면, 컴퓨터 제어 병진 무대 임플란트의 길이를 따라 Z-스택 파노라마를 수집하는 영상 중에 사용됩니다. 영상뿐만 아니라 임플란트에서 돌아온 레이저 반사율를 수집, 조직 라벨을 적용및 조직 도움말 모두를 통해 전송 빛이 조직을 주변에 관련 장치 인터페이스를 현지화. 조직이 '디바이스 캡처 조직학 "을 사용 준비 (DCHist) 프로토콜은 morphologically 보존 조직 / 장치의 상호 작용에 대한 이미징 액세스를 제공하므로 이전 장치 제거 조직 학적 프로토콜 18시 향상시킵니다.
여기 보여 "디바이스 캡처 조직학"(DCHist) 메서드는 뇌 조직과 조직 이식 사이의 morphologically 보존의 상호 작용 가까운 조직 학적 평가를 할 수 있습니다. DCHist 조직 컬렉션은 뇌에 이식 구성 요소에서 두개골에 장착 된 장치 구성 요소의주의 분리가 필요합니다. DCHist 또한 두꺼운 조직 학적 조직 슬라이스 (> 250 μm)의 수집이 필요합니다. 이러한 조직 섹션은 한 번, 라벨 삭제, 장착 및 이미징, 주입 부상이나 내재하는 장치에 후속 만성 반응으로 소설 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 그림 3-5와 같이 고급 현미경 도구를 사용하여 조직 및 장치 사이의 인터페이스는 이미징 될 수 있으며, 높은 자세히 분석했다.
현재의 형태로 제시 기술은 천천히 내려 장치 주입의 포인트를 두 부분으로 치과 시멘트와 편의점 – 실에서 만든 headcap을 멀리 발굴 할 수있는 능력에 의존하고 있습니다.타 버렸하거나 제거 할 수 치과 시멘트와 작은 가위가 시각적으로 크게 성공적으로 두개골에 장착 된 구성 요소에서 주입 장치를 분리에 도움이 안내 할 수있는을 통해 명확한 실리콘 엘라스토머를 활용. 현장에서 수집하기 위해 두개골 밑과 뇌 위의 장치를 자르고 것은 두개골 마운트 임플란트가 뇌에 많은 양의를 꺼내는 될 것 같은 권장하지 않습니다.
이러한 NeuroNexus 기술에서 단일 생크 MEAs와 같은 얇고 작은 이식은, DCHist 가장 의무가 있지만 원칙은 단일 장치 정강이 또는 microelectrode 배열로 제한되지 않습니다. 수집 및 이미징 전략이 요구들이 어떤 두개골 마운트에서 분리 두꺼운 조직 섹션에서 수집해야하는이되면, 멀티 생크 장치 및 cannulas과 같은 큰 임플란트에 광범위하게 적용 할 수 있습니다. 저자는 조직의 분석에 초점을 맞추고 있지만주변 피질 이식은 뇌에 깊이 구동 장치는 수집 이미징 될 수 있습니다. 임플란트 삽입의 깊이는 장치가 삽입 알려진 각도에서 격렬하게 이탈하지 않는 제공하는 슬라이스에 보형물의 캡처에 영향을 미치지 않습니다.
제한 DCHist 방법의 유용한 응용 프로그램에 존재합니다. 광학 개간 솔루션은 크게 다양한 조직 21 이미징 깊이를 향상시킬 수 있지만 뇌 조직 섹션, 특히 흰색 물질의 영역에서 마이크로 미터의 수백을 통해 이미지를 도전하고 있습니다. 더 이미징 깊이를 개선하기 위해, 두 광자 여기 현미경은 설명 광학 개간과 함께 사용될 수있다.
설명 방법의 또 다른 잠재적 인 제한은 연구자에 의해 고용 특정 형광 immunohistochemistry 방법 및 항체 할 수 있습니다. 수동 확산은 일반적으로 고정 된 조직을 통해 이러한 마커의 설립을 유도와 항원 바인딩 사이트로. 최종 항체 작업 농도는 배경 라벨의 높은 수준을 피하는 동안 라벨 침투를 극대화하기 위해 사례별로 연구자에 의해 결정되어야합니다. 항체 라벨이 동일하게 처리됩니다 조각 사이에 변수이 아니어야하지만, 다른 항체 일부 항체를 쉽게 항원에게 마이크로 미터 만 수십 깊은 항원의 라벨을 여러 깊이 수백 마이크로 미터와 다른 라벨과 함께 자신의 항원에 침투 태그 능력에 상당히 다를 수 있습니다. 우리는 응용 프로그램의 여러 일 동안 전형적인 농도보다 높은에서 항체 라벨을 적용하여이 확산을 개선하고, 희석 세제를 포함하고 혈청을 차단 솔루션 인치 설명 정기적으로 조각을 내리고하면 더 라벨을 촉진합니다. 항원 검색 단계 및 대체 고정 프로세스 (예 : 글 루타 알데히드, 전자 레인지 등) 특정 항원에 적합 할 수 있습니다. 항체 – fluoroch 차이것은 Invitrogen에서 알렉사 형석 레이블을 사용하여 저자가 관찰되지 않았습니다 불구하고 로마 conjugates 또한, 두꺼운 부분을 라벨의 성능이 다를 수 있습니다. 또는 관심의 세포 유형에 형광 단백질을 표현 형질 전환 동물 과목은 항체 라벨 침투 문제를 방지하기 위해 활용 될 수있다 eGFP 많은 형광 단백질로, 포름 알데히드 처리 한 후 자신의 형광을 유지하고, 조직 섹션에서 즉시 시각화 할 수 있습니다.
DCHist은 뇌 조직에 주입 microdevices의 영향을 캡처하고 분석하는 기술의 강력한 집합입니다. 전기 생리학 품질과 전극 임피던스 데이터를 22 생체 평가에 사용하여이 조직 학적 프로토콜을 결합하는 것은 크게 생리학의 다양성과 저하의 생물 자원에 대한 우리의 이해를 향상시킬 수. 특히 이식 신경 보철 장치의 필드는 자세한 DCHist IMA 혜택을 누릴 수 있습니다생물학적으로 중립적 인 MEA 장치의 발전을 알려 손상 장치 / 조직 인터페이스 ging.
The authors have nothing to disclose.
모든 실험은 퍼듀 동물 관리 및 사용위원회와 Purdue 대학의 실험실 동물 프로그램의 감독하에 수행되었다.
이 작업은 통해 신뢰할 수있는 신경 기술 프로그램의 일환으로 박사 잭 W. 주디 (jack.judy @ darpa.mil)의 후원하에 국방 고급 연구 프로젝트 기관 (DARPA) 마이크로 기술 사무소 (MTO)에 의해 후원되었다 공간과 해군 전쟁 시스템 사령부 (SPAWAR) 시스템 센터 (SSC) 태평양 부여 번호 N66001-11-1-4013.
저자는 자신의 현미경 전문 지식을 공유 미하일 Slipchenko, 돈 준비, 그렉 리히터, 아론 테일러, 그리고 케빈 Eliceiri 감사드립니다.
Reagents | |||
Hoechst 33342 | Invitrogen | 14533 | DNA marker |
Rabbit anti-Iba1 | Wako (Japan) | 019-19741 | Monocyte antibody |
Dental acrylic | Lang Dental (various distributors) | Jet Denture Repair Powder & Liquid | Headcap construction |
Kwik-Sil | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Covering exposed cranial implants |
Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | Tissue processing |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | Tissue processing |
Urea | Sigma-Aldrich | U4883 | Clearing solution |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G20225 | Clearing solution |
Equipment | |||
Curved micro-scissors | World Precision Instruments | 14208 | Cutting implant before removing brain |
Razor blades | Ted Pella | (various sizes) | For use with Brain Block |
Acrylic Brain Matrice | Ted Pella | 15054 | Brain Block to create initial plane in tissue |
Plastic slides | Ted Pella | 260225 | Mounting tissue |
Cover glass | Ted Pella | (various sizes) | Mounting tissue |
Electrode arrays | NeuroNexus Technologies | (various designs) | Example MEAs |
Vibratome | Leica | VT1000 S | Specific system used in presented method |
Vibratome blades | (various suppliers) | Collecting slices | |
24-well plates | (various suppliers) | Storing and processing tissue slices | |
Confocal microscope with motorized XY-scanning stage | Carl Zeiss Microscopy | Zeiss LSM 710 and ‘Zen 2010’ software | Specific system used in presented method |
Soldering iron | (various suppliers) | Excavating headcap |