脳移植マイクロデバイス及び周辺組織の無傷の組織学的性状

ソリューション pH7.4で9グラムのNaCl、0.144グラムのKH 2 PO 4、0.795グラムのNa 2 HPO 4、; G / Lで- リン酸緩衝生理食塩水（PBS） 4％ホルムアルデヒド -ミリリットル/リットルで、202ミリリットルナトリウム二塩基性リン酸ナトリウム溶液（0.4 MのNa 2 HPO 4）、48ミリリットルの一塩基性リン酸ナトリウム液（0.4MのNaH 2 PO 4）、500ミリリットル8％ホルムアルデヒド溶液、250ミリリットルのMilli- pH7.4のQ DDI水、 HEPESはアジ化ナトリウム（HBHS）とハンクス緩衝生理食塩水 – G / Lで、7.5グラムのNaCl、0.3グラムのKCl、0.06グラムのKH 2 PO 4、0.13グラムのNa 2 HPO 4、2gのグルコース、2.4グラムのHEPES、0.05グラムのMgCl 2 6部のH 2 O、0.05グラムMgSO 4を 7部のH 2 O、0.165グラムのCaCl 2、pH7.4で0.09グラムのNaN 3 洗浄液（WS） – 1％体積/体積、NORアジ化ナトリウム（NaN 3を ）とHBHSにおけるMALヤギ血清、0.3％トリトンX-100、。 4℃、後続のステップで使用する前にWSを冷蔵してください。 U2スカL Eソリューション – 4 M尿素、30％グリセロール、0.1％トリトンX-100 17 PROCEDURE 全ての実験は、パーデュー大学の動物実験委員会とパデュー大学実験動物プログラムの監督の下で行われた。 1。手術様々な無菌手術方法は、提示された組織学的方法と互換性があります。定位フレームと自動インサータの使用は、定位の面に関して再現性と微小電極アレイ（MEA）の制御注入角度を改善するために推奨されています。 注：このデモでは私たちの手術方法は次のとおりです。定位earbars薬用に、げっ歯類の件名を保持イソフルラン麻酔下でeは（1-3％の間）は、医療グレードの酸素によって運ばれる。つま先ピンチの欠如のための試験は、動物が完全に麻酔であることを確認するためにマウスの尾ピンチ反射のラットまたは不足に反映されます。眼軟膏を塗布し、ベタジンとエタノールの3交互に洗浄して手術部位を清掃してください。手を洗う、夜明け手術用手袋、ヘアネット、マスクとガウン。 、手術領域を麻痺はさみや骨スクレーパーと綿のアプリケーター付きメス、明確骨膜を用いた切開を作成し、歯科用ドリルハンドピースとドリルビットを使用して開頭術を作成するためにリドカインのボーラスを注入します。マイクロマニピュレーターを用いて大脳皮質にシングルシャンクMEAを駆動します。無菌手術の条件を維持するために外科助手の援助を持っており、手術の進行状況を文書化します。 脳へのMEAの注入に続いて、Bの周りから頭蓋骨の最終的除去を知らせるために手術用顕微鏡を介して画像を収集雨。デバイスの移植部分はその場で保存されます。 注：現場のデバイスの持つ組織の最終的なコレクションは、密接に組織切片の平面を持つデバイスの挿入面をマッチングに依存しています。脳への相対的な装置の挿入面について詳細なメモは、このように非常に重要である。 デバイス注入後、任意の露出MEAシャンクまたはケーブルの周りに、シリコーンエラストマークウィク-SIL（WPI）を適用し、治すことができます。例えばカットピペットチップとして滅菌プラスチック片は、硬化しながら開頭の周りの小さな井戸におけるシリコーンエラストマーを含めるために使用されるかもしれません。 クイック·ジンシル、公開された頭蓋骨の上の2つの部分からなる歯科用アクリル（ "ジェット液体"とラング歯科から "ジェットパウダー"）の層を適用します。 注意 ：以降のステップでは、headcapは分離されるべきインプラントを可能にするために経由して溶融され頭蓋骨から。この非常に硬質アクリル、後で除去することが困難であるとして、UV硬化アクリルは、クイック·ジンシルと開頭の上に避けるべきである。インプラント周囲に視覚的に不透明材料も回避すべきである;クリアクウィク-Silはこのプロトコルの後続のステップの間にインプラントのビューを提供します。 動物愛護条例のローカルプロトコルに従って術後ケアの手順を実行して、シングルケージに収容され、箱に歩行する被験者を返す。 2。灌流および組織採取 注：ゲージらを参照してください。ラット動物モデル19の詳細な灌流手順のチュートリアルの。 金融機関の動物のケアと使用委員会によって承認され麻酔し、灌流プロトコルを使用しています。深くげっ歯類（ラットまたはマウスにおけるテールピンチ反射でつま先のピンチ反射の欠如によって確認された）麻酔し、心臓を露出させた後、はさみで浅いカットを作る左心室と右心房へ。左心室に鈍針を挿入し、部屋一時PBSを届ける。ラットにおける〜100ミリリットル/分で、マウスで〜5 mL / minで約200 mlのPBSで〜10mlのPBSの合計を提供します。中に肝臓から血中クリアランスを探してください。 所望であれば気泡を導入することを避けるように注意注意して注射器の配信によって、transcardially組織学的に関連する化学のラベルを注入します。 注：血管ラベル（ 例えば DII）と核酸対比染色色素（ 例えばヘキスト33342）が灌流時成果物化学ラベルの例です。適切に投与される場合、これらの組織学的マーカーが全体の動物20を付けなければなりません 。 動物を修正するtranscardiallyバッファリングされた、室温、4％ホルムアルデヒドを提供します。灌流時に肺鼻排水によって証明することができる心の向こう側隔穿孔を避けてください。大きな筋肉で固定の震えを探す完全灌流を示すことができます。マウスで〜5ml /分およびラットで〜100ml /分で約200mlの固定液で〜10mlの固定の合計を提供します。 次の灌流、動物の首を、4℃で一晩、4％ホルムアルデヒド溶液でrongeurs、ハサミと場所のヘッドを使用して脳幹や小脳の一部を露出℃に洗浄の間一から四時間の間隔で、PBSで3回頭を洗ってください。 ヶ月日間、4℃でアジ化ナトリウムを含むHBHSに固定ヘッドを格納します。 3。 現場デバイスの持つ脳の取り外し 注：適切な個人用保護具を着用した状態で、ドラフト内では、このセクションを実行します。定期的にソリューションをHBHSする固定ヘッドを返すことによって、組織の乾燥を避けてください。 慎重にピンセットや小さなハサミを用いてアクリルスカルキャップの周りから皮膚や他の組織を離れて解剖する。 熱-iを装着したままnsensitive手袋は、歯科用アクリルを削除してクイック·SIL（ 図2a）明確な基盤となる領域を露出させるために、はんだごてを使用します。 注：このステップの目的は、脳移植のコンポーネントが頭蓋骨に固定成分から分離することができるように、マイクロはさみ移植デバイスが脳に入る位置へのアクセスの適切な角度を可能にすることです。 手術用顕微鏡下に、下にデバイスが脳に入る位置にピンセットでクイック·ジンシルの小片を除去し、湾曲したマイクロはさみでシリコーンエラストマーに切る。 脳に移植部品からポリシリコンと頭蓋骨に取り付けられた別のデバイス·コンポーネントに湾曲したマイクロハサミで開頭の表面に沿って切断を続行します。露出したデバイスコンポーネントを切断するときに再度impを押すか、またはドラッグしないように注意しながら、顕微鏡の倍率と細心の注意を使用する固定組織でlants。 rongeursを使用して注意してheadcapの周りの骨を削除します。頭蓋骨から注入された機器と脳を分離するためにへらを使用しています。スライスする準備ができるまでHBHS溶液中で脳に保管してください。 HBHSで満たされたガラスシャーレに脳を置き、彼らがデバイス注入の場所に関連しているかどうかに応じて、例えば脊髄、小脳、または嗅球として、無関係な組織を除去するためにカミソリの刃を使用しています。セクションに脳を脳ブロック（テッド·ペラ）とかみそりの刃を使用し、密接に植え込まれたデバイスの角に一致する平面を作成し、これはそのような任意のその脳を方向付け、適切なサイズの脳ブロックで脳を配置することによって達成されるインプラントの目に見える部分は、カミソリの刃のガイドと一緒に平行であり、インプラントから少なくとも2ミリメートルブレードガイドにカミソリの刃を配置する。組織を介して、カミソリの刃を押します。ビブラトームプラットフォームにこの面をマウントします。オルタナtively、マイクロマニピュレーターにマウントされたカミソリの刃は、密接に、インプラントの方向と一致する平面を作成するために、脳のブロ​​ックと同様に制御された方法で使用することができます。 場所はビブラトームプラットフォーム下の氷、そして、組織表面が簡単にペーパータオル上で乾燥させた後、スーパー接着剤を使用してビブラトームに脳を遵守します。接着剤は、前のステップで作成されたフラット·組織面では、ステージにある。非対称の組織の大きさで、東洋最大幅が潜在的に組織の上をたたいて刃を避けるためビブラトームブレードの移動方向と平行ダウン接着されたことなどのサンプル。接着剤セット（〜1-2分間）した後、チルド追加（〜4℃）、PBS組織の周りビブラトーム皿に。 HOから10°の刃角で、最大振動速度（〜100 Hz）と遅い刃の進行速度（毎秒<0.2 mm）を使用して、制御組織を含む200から400μmの間に厚い組織切片を収集rizontal。 4で、24ウェルプレートでHBHSでブラシやスコップへらや店舗で丁寧にスライスを収集℃に 現場装置で肉眼または手術用顕微鏡に表示されていれば、100μm以下のスライス単位で装置に接近するシンナーのセクションを収集します。 注意：代表的なシリコンマイクロインプラントは、デバイス表面から300〜500μmのホルムアルデヒド固定した齧歯類大脳皮質組織中の肉眼で見ることができます。 現場装置内で今、組織の表面に近い内にデバイスが含まれている> 250μmの組織切片を収集します。必要な厚さの推定は、以前に収集されたスライスを参照することによって支援することができます。 注：大型のデバイス、multishankデバイス、および角度のデバイスは1組織片でデバイスをキャプチャするために、より厚い組織切片（> 500μm）を必要とするかもしれません;再適用されたラベルの浸透と顕微鏡イメージング·深さの両方がこれらの非常に厚いスライスから最終的なデータ収集に制限されることをメンバー。可能であれば、これは組織的および形態学的変形を介してデバイスのドラッグ原因となりますので、ビブラトームブレードを使用してデバイスをぶつからない。 4。組織の処理とクリア HBHSで洗浄あたり5分で3倍のスライスを洗う 30分合計の水素化ホウ素ナトリウム（HBHSの5mgのNaBH 4月 1日ml）を（15分スライスのそれぞれの側）でインキュベートする。ステンレス鋼またはテフロンコーティングされたマイクロスプーンと小さな絵筆（テッド·ペラ）を使用してスライスを反転します。ゆっくりと思いやりの動きが各スライスフリップの成功を向上させる。ブラシを使用して埋め込まれた装置の周りの任意の領域に触れないようにしてください。可能な場合には、必要な（> 2ミリリットル）よりもはるかに多くのソリューションを追加すると、1がより容易に組織切片を操作し、反転させることができます。 <p class="jove_content"> 注意：この手順では、内因性の自家蛍光を低減し、蛍光標識が灌流の間に適用またはXFPジェニックマーカーが存在していた場合は、このステップをスキップします。 室温で洗浄液で洗浄あたり5分で3倍のスライスを洗う。 注意：洗浄及びインキュベーションステップ中の撹拌はオプションです。著者らは、周囲の脳組織に対して硬いインプラントの微妙な不快感を与えるが、攪拌で発生する可能性があると推測している。ソリューションの動きを向上させながらしかし、穏やか率（<60 rpm）で動く軌道ミキサーはこれを回避することができる。 室温で洗浄液に2時間（1時間後にフリップスライス）用のブロック。 4℃で約48時間（スライスの各側に24時間）のために一次抗体（洗浄液で希釈）でインキュベートする洗浄溶液で6クイック3分の洗浄を行います。 6日1時間の洗浄（3洗浄を行う洗浄溶液中の組織切片の両側にes）（4℃で保存晩洗濯する場合）。 4℃で約48時間（各側に24時間）のために二次抗体（洗浄溶液で希釈したもの）でインキュベートする洗浄溶液で6クイック3分の洗浄を行います。 一晩洗濯場合は4℃で保存、洗浄溶液中の6,1時間の洗浄（各側面に3回の洗浄）を行います。 決済ソリューション-ソリューションを洗い、グリセロールベースの"sca l e u2"を追加して削除します。 4℃で非常に厚い組織切片（>500μm以下）の厚いスライス（250から500μm）または2〜3週間に約1週間をクリアすることができます 4℃で箔とストアとカバープレートマウントメディアとして清算ソリューションを使用して、明確なマニキュアで封厚い組織切片（ 図2b、2c）を収納するスライドにマウントします。 4℃で保存光年からのC。 5。フルTiのパノラマ画像ssueおよびデバイス·インタフェース長期作動距離顕微鏡対物レンズ（> 2mm）を用いて、共焦点顕微鏡や2光子レーザ走査型顕微鏡でイメージングを開始します。我々は、ツァイスLSM 710、Carl Zeissの "禅"ソフトウェア（2010）、画像、インプラントの周囲に3Dパノラマを、コンピュータ制御されたXY変換ステージとデモンストレーションを行います。 注：いずれかのソフトウェアで、客観的に是正襟裏、または収集後のデータ処理における決済ソリューションの屈折率の正しい。このデモでは、我々はライカ禅顕微鏡ソフトウェアに1.4の "U2"の決済ソリューションの屈折率の値を入力し、この設定が微妙に屈折率のミスマッチを考慮するために、Z-ステップ間隔を調整します。 デバイスの近くで組織においては、概ね低レーザパワー（〜0を使用して、各蛍光チャネルに対してz次元の適切なz軸ウィンドウとデータ収集の設定を評価する0.5から5までパーセント）と大きなz-ステップサイズ（> 25μm）である。 注：追加の上の空間と下の組織は、スライドガラス（〜20μmの各方向）に完全に平らになるわけではないので、パノラマのデータ収集のためにセットアップするときに、z軸を設定することが含ま。 あなたの最終的なパノラマのxy中心に目標を設定し、禅パノラマソフトウェアを使用して、関心のあるあなたの地域をカバーするために、各軸（xとy）に必要な収集位置の数を決定します。 z軸コレクション·ウィンドウを再評価し、完成させる。 手動で増加した深さで適切に上昇するため、検出器の感度とレーザパワーを設定します。目的は、組織切片にかかわらず撮像深度とほぼ同じ画像強度を維持することが、高バックグラウンドノイズをも回避することが典型的である。 各蛍光画像データシリーズを収集します。信号が重ならないように、必要に応じて、レーザーラインを実行します。順次だ。 注：利用可能な場合には、自動的にコレクションにハードディスクにデータを保存するために、ソフトウェアを設定します。 "反射"と"透過率"データを収集するために、ソフトウェアの設定を変更し、これらのチャネルを捕捉するために、より長く浸透波長レーザー（ 例えば 633 nm）を使用しています。 "反射"と "透過"コレクションのために適切なレーザパワーと検出器の感度を決定し、移植された装置の周りに同じコレクションシリーズを繰り返す。 後で処理し、定量化、および分析のためのデータをエクスポートします。