כאן אנו מציגים שיטה היסטולוגית ללכיד, סימון, ניקוי אופטי, והדמית ממשק רקמת המוח השלם סביב microdevices המושתל כרוני ברקמת מוח מכרסם. תוצאות מהטכניקות הכוללות בשיטה זו הן שימושיות להבנת ההשפעה של-שתלים במוח חודרניים שונים ברקמות המקיפות אותם.
מחקר לעיצוב והניצול של microdevices מוח מושתל-, כגון מערכי microelectrode, שואף לייצר מכשירים רלוונטיים קליני כי ממשק כרוני עם רקמות מוח. רקמה הסובבת שתלים אלה היא חשב להגיב לנוכחות של המכשירים לאורך זמן, הכוללת את הקמתה של "צלקת גלייה" בידוד סביב את המכשירים. עם זאת, ניתוח היסטולוגית של רקמות שינויים אלה מבוצע בדרך כלל לאחר explanting המכשיר, בתהליך שיכול לשבש את המורפולוגיה של הרקמה של עניין.
כאן אנו מדגימים פרוטוקול שבו התקנים מושתלים-קליפת המוח נאספים שלמים ברקמות מוח מכרסם. אנו מתארים כיצד, perfused פעם אחת עם מייצב, מוח מוסרים ופרוסים בדרך שתמנע מכשירי explanting. אנחנו נתווה תיוג נוגדן ניאון ושיטות סליקה אופטיות שימושיות לייצור רקמות אינפורמטיבי, עדיין עבותסעיף. לבסוף, אנחנו מדגימים את ההרכבה וההדמיה של חלקי רקמות אלו על מנת לחקור את הממשק הביולוגי סביב מכשירי מוח מושתל.
תחום neuroprosthetic המחקר נועד לסייע לאנשים הסובלים ממוגבלויות והפרעות שונות, תוך עקיפת מבנים חולים או פגומים בגוף דרך מערכת העצבים מרכזיים המשיקה 1,2 התקנים. microdevices מוח מושתל-, כגון מערכי microelectrode (MEAs), ניתן להשתמש בו כדי להקליט או לגרות מבנים מוחיים, וכך תאפשר את הקמת ממשקים ארוכי טווח בין אלקטרוניקה ורקמות CNS 3-5. MEAs החודרני, מכשירים המונעים לרקמת המוח, לקיים הבטחה מסוימת כממשקים דו כיווניים בשל סמיכות שבמסגרתו הם מציגים את האלקטרודות לקבוצה קטנה יחסית של נוירונים סמוכים 6.
עם זאת, תוצאה מורכבת רקמת תגובות מהשתלה לטווח הארוך של MEAs הנוקב, לעתים קרובות וכתוצאה מכך יחסים אלקטרופזיולוגים משתנים ובהדרגה משפילים אות לרעש מעל ימים עד חודשים, ועלייה בimped החשמליאהה בין אתרים אלקטרודה והקרקע 7,8. מקורותיה המשוערים של שינויים אלה כוללים הפעלה של מיקרוגליאה, astrocytosis תגובה לאורך microdevices, והפסד או הגירה של תאי עצב מהרקמה הסובבת להתקנים מושתלים 9-11. אתגר מרכזי להבנת שינויים ברקמות מסביב, MEAs חדירה הכרוני הוא הקושי בלכידת נתונים היסטולוגית של ממשק הרקמה השלם מסביב התקנים מושתלים כרוני 12. ניתוח היסטולוגית של הרקמה עם הממשק עדיין קיים מכשיר / רקמות הייתי לשפר את הפרוטוקולים היסטולוגית מכשיר להסרה הנוכחיות. עם מכשיר ללא הפרעה שנותר ברקמה, ההשפעה הביולוגית של אינטראקציות יחסית עדינות, כגון ניצול של ציפויים ביולוגיים 13,14 או סליקה החשמלית של משטח אלקטרודה 15,16, יכולה להיות צלמה ונתחה ביחס לשתל.
Hפה אנחנו מדגימים שיטה לאסוף, לעבד, ותמונת ממשק microdevice השלם לניתוח מפורט מבוסס מיקרוסקופיה של רקמת המוח שמסביב. בשיטה זו, המכשיר ורקמות מוח נאספים בתוך עבה (> 250 מיקרומטר) סעיף רקמות באמצעות vibratome. כדי לשפר את חדירת תווית היסטולוגית לפרוסות עבות האלה, תוויות וhistochemical immunohistochemical ניאון מיושמות בריכוזים גבוהים בפתרונות המכילים סרום וחומר ניקוי חסימה למספר רבים של ימים. פתרון סליקה אופטית מועסק לשפר מעמקי הדמיה מיקרוסקופית, והרקמה היא רכובה בתאים 2-צדדיים למיקרוסקופיית ליזר לאחר confocal 17. כדי ללכוד את הממשק היסטולוגית המלא, שלב translational מבוקר מחשב משמש במהלך ההדמיה לאסוף פנורמות Z-מחסנית לאורכו של שתלים. בנוסף להדמיה להחיל תוויות רקמות, איסוף החזרת ליזר חזרה משתליםוהעברת אור דרך הרקמה הן לסייע בתרגום ממשק המכשיר ביחס לרקמות. רקמה הוכנה באמצעות "התקן-Capture היסטולוגיה" זה (DCHist) פרוטוקול מספק גישת הדמיה לאינטראקציות השתמרה מורפולוגית הרקמות / מכשיר, ובכך משפר עם פרוטוקולי מכשיר להסרה היסטולוגית קודמים 18.
שיטה "התקן-Capture היסטולוגיה" (DCHist) הפגינה כאן מאפשרת הערכה היסטולוגית הקרובה של אינטראקציות השתמרו מורפולוגית בין רקמת מוח ושתלי רקמות. אוסף רקמות DCHist דורש הפרדה זהירה של רכיבי מכשיר גולגולת רכובה מרכיבים המושתלים במוח. DCHist דורש גם אוסף של פרוסת רקמה היסטולוגית עבה (> 250 מיקרומטר). סעיפי רקמות אלה, שכותרתו פעם אחת, פינה, משובצים, והדמיה, יכולים לספק תובנה חדשות לפציעה או השתלת תגובה כרונית לאחר התקני שכינה. שימוש בכלים מתקדמים מיקרוסקופיה, בממשק בין רקמות ומכשיר יכול להיות צלם ונתח בפירוט גבוה כפי שמוצג במספרי 3-5.
את הטכניקות שהוצגו בצורתם הנוכחית מסתמכות על היכולת לחפור לאט headcap עשוי מבטון בשני חלקי שיניים וKwik-סיל עד לנקודה של השתלת מכשיר.ניצול מלט שיניים שניתן נשרף או אחר הוסר ואלסטומר סיליקון ברור שדרכו ניתן להנחות מספריים קטנים חזותי לסייע מאוד בהפרדת המכשיר המושתל בהצלחה ממרכיביה גולגולת רכובה. מנסה לחתוך את המכשיר תחת הגולגולת ומעל למוח על מנת לאסוף אותו באתרם אינו מומלץ, כמו שתל גולגולת הרכובה יהיה נשלף ממוח כמות משמעותית.
אמנם רזים שתלים, קטנים יותר, כגון MEAs סבך בודד מטכנולוגיות NeuroNexus, ניתנים ביותר DCHist, העקרונות אינם מוגבלים למכשיר אחד שאנקס או מערכי microelectrode. אוסף ואסטרטגיות הדמיה הם רחב החל על מכשירים רב סבך ושתלים גדולים יותר כגון cannulas, בדרישות להיות שהם חייבים להיות מופרדים מכל הר גולגולת ואספו בתוך קטע רקמה עבה. למרות שהכותבים מתמקדים בניתוח של רקמהשתלי קליפת מוח שמסביב, מכשירים המונעים עמוק יותר לתוך המוח יכולים גם להיות שנאספו וצלמו. עומק החדרת שתל לא אמור להשפיע על לכידתו של השתל בפרוסה ספקה המכשיר אינו חורג בפראות מהזווית הידועה של כניסה.
מגבלות קיימות ליישום היעיל של שיטת DCHist. חלקי רקמת המוח מאתגרים לתמונה באמצעות מאה מיקרומטרים, במיוחד באזורים של חומר לבן, אם כי פתרוני סליקה אופטיים יכולים לשפר מעמקי הדמיה ברקמות שונות 21 באופן משמעותי. כדי לשפר עוד יותר את עומק הדמיה, מיקרוסקופיה העירור שני פוטונים יכולה להיות מועסקת יחד עם הסליקה האופטית תארה.
מגבלה אפשרית נוספת של השיטה שתוארה יכולה להיות השיטות הספציפיות ניאון אימונוהיסטוכימיה ונוגדנים המועסקים על ידי חוקרים. דיפוזיה פסיבית בדרך כלל מניעה את השילוב של סמנים אלה דרך רקמות קבועותועל אתרי אנטיגן מחייבים. ריכוזים עובדים נוגדנים סופיים צריכים להיקבע על ידי חוקרים בכל מקרה לגוף על מנת למקסם את חדירת תווית תוך הימנעות רמות גבוהות של תיוג רקע. תיוג נוגדן לא צריך להיות משתנה בין פרוסות המעובדות באופן זהה, אך נוגדנים שונים עשויים להשתנות במידה ניכרת ביכולתם לחדור ולתייג אנטיגן שלהם, עם כמה נוגדני תיוג קלות אנטיגנים מאה רבות של מיקרומטר עמוקות ואחרים תיוג אנטיגנים רק עשרות של מיקרומטרים עמוקים. אנו מתארים שיפור דיפוזיה זו על ידי החלת תוויות נוגדנים בריכוזים גבוהים יותר מרגילים, לימים מרובים של יישום, ובתמיסה המכילות חומר ניקוי מהול וחסימה בסרום. מעת לעת מרפרף את הפרוסות גם מקדם אף תיוג. צעדי אחזור Antigen ותהליכי קיבעון חלופיים (glutaraldehyde, מיקרוגל, וכו 'למשל) עשויים להיות מתאימים לאנטיגנים ספציפיים. נוגדני fluoroch משניconjugates rome עשוי גם להשתנות בביצועים שלהם תיוג חלקים עבים, למרות שזה לא נצפה על ידי המחברים באמצעות תוויות Alexa פלואוריד מInvitrogen. לחלופין, נושאי בעלי חיים מהונדסים המבטאים חלבוני ניאון בסוגי התאים של עניין עשויים להיות מנוצלים כדי למנוע בעיות עם חדירת תווית נוגדנים, כמו חלבוני ניאון רבים, כגון eGFP, לשמור הקרינה שלהם לאחר טיפול פורמלדהיד, ועלול להיות מייד דמיינו בסעיפי רקמות.
DCHist היא קבוצה חזקה של טכניקות כדי ללכוד ולנתח את ההשפעה של microdevices מושתל ברקמת המוח. צימוד זה עם פרוטוקול היסטולוגית בהערכת vivo של איכות electrophysiology ונתוני עכבת אלקטרודה 22 יכול לשפר באופן משמעותי את הבנתנו את המקורות הביולוגיים של השתנות פיזיולוגיה והשפלה שלנו. התחום תותב עצבי מושתל בפרט עשוי ליהנות מDCHist ima המפורטגינג של ממשק שלמות המכשיר / רקמות להודיע פיתוח נוסף של מכשירי MEA ביולוגי ניטראליים.
The authors have nothing to disclose.
כל הניסויים נעשו תחת פיקוחו של הטיפול בבעלי חי פרדו והשתמש ועדה ותכנית חי המעבדה באוניברסיטת Purdue.
עבודה זו מומנה על ידי הגנת המחקר המתקדם פרויקטי הסוכנות (DARPA) Microsystems טכנולוגית המשרד (MTO), תחת חסותו של ד"ר ג'ק וו ג'ודי (jack.judy @ darpa.mil) כחלק מתכנית לטכנולוגיה העצבית האמינה, דרך החלל וחיל ים Warfare מערכות פיקוד (SPAWAR) מערכות המרכז (SSC) השקט גרנט מס N66001-11-1-4013.
המחברים מבקשים להודות למיכאל Slipchenko, דון מוכן, גרג ריכטר, אהרון טיילור, וקווין Eliceiri לשיתוף המומחיות המיקרוסקופית שלהם.
Reagents | |||
Hoechst 33342 | Invitrogen | 14533 | DNA marker |
Rabbit anti-Iba1 | Wako (Japan) | 019-19741 | Monocyte antibody |
Dental acrylic | Lang Dental (various distributors) | Jet Denture Repair Powder & Liquid | Headcap construction |
Kwik-Sil | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Covering exposed cranial implants |
Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | Tissue processing |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | Tissue processing |
Urea | Sigma-Aldrich | U4883 | Clearing solution |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G20225 | Clearing solution |
Equipment | |||
Curved micro-scissors | World Precision Instruments | 14208 | Cutting implant before removing brain |
Razor blades | Ted Pella | (various sizes) | For use with Brain Block |
Acrylic Brain Matrice | Ted Pella | 15054 | Brain Block to create initial plane in tissue |
Plastic slides | Ted Pella | 260225 | Mounting tissue |
Cover glass | Ted Pella | (various sizes) | Mounting tissue |
Electrode arrays | NeuroNexus Technologies | (various designs) | Example MEAs |
Vibratome | Leica | VT1000 S | Specific system used in presented method |
Vibratome blades | (various suppliers) | Collecting slices | |
24-well plates | (various suppliers) | Storing and processing tissue slices | |
Confocal microscope with motorized XY-scanning stage | Carl Zeiss Microscopy | Zeiss LSM 710 and ‘Zen 2010’ software | Specific system used in presented method |
Soldering iron | (various suppliers) | Excavating headcap |