Hier präsentieren wir eine histologische Verfahren zur Erfassung, Kennzeichnung, optisch Löschen und Bildgebung des intakten Hirngewebe Schnittstelle um chronisch implantierten Microdevices im Hirngewebe von Nagern. Ergebnisse von den Techniken, die diese Methode sind nützlich für das Verständnis der Auswirkungen von verschiedenen durchdringenden Gehirn-Implantate auf ihre umliegende Gewebe.
Die Erforschung der Gestaltung und Nutzung des Gehirns implantiert Microdevices, wie Mikroelektroden-Arrays, soll klinisch relevanten Geräte, die chronisch-Schnittstelle mit dem umgebenden Hirngewebe zu produzieren. Gewebe um diese Implantate ist vermutlich auf die Anwesenheit der Geräte im Laufe der Zeit, welche die Bildung eines isolierenden "glialen Narbe" um die Geräte umfasst reagieren. Jedoch wird histologische Analyse dieser Gewebsveränderungen typischerweise nach Explantation das Gerät durchgeführt wird, in einem Prozess, der die Morphologie des Gewebes von Interesse stören können.
Hier zeigen wir ein Protokoll, in dem kortikalen implantierten Geräten gesammelt intakt umgebenden Hirngewebe von Nagern sind. Wir beschreiben, einmal mit Fixiermittel perfundiert werden Gehirne entnommen und geschnitten in einer solchen Weise, dass Explantieren Geräten zu vermeiden. Wir skizzieren Fluoreszenz-Antikörper-Kennzeichnung und optische Clearing-Verfahren nützlich zur Herstellung eines informativen, aber dickes GewebeAbschnitt. Schließlich zeigen wir die Montage und Bildgebung dieser Gewebeschnitten, um die biologische Grenzfläche herum brain-implantierten Vorrichtungen zu untersuchen.
Das Gebiet der Forschung soll neuroprothetische Individuen leiden unter verschiedenen Behinderungen und Störungen durch Umgehen erkrankten oder geschädigten Strukturen im Körper durch ZNS Schnittstellenvorrichtungen 1,2 unterstützen. Brain-implantierten Microdevices, wie Mikroelektroden-Arrays (MEAs), können verwendet werden, um aufzuzeichnen oder zu stimulieren Hirnstrukturen, und ermöglichen so den Aufbau von langfristigen Schnittstellen zwischen Elektronik und ZNS-Gewebe 3-5 werden. Durchdringenden MEAs, Vorrichtungen, die in das Gehirngewebe angetrieben werden, halten besonders vielversprechend als bidirektionale Schnittstellen aufgrund der engen Nähe innerhalb der sie präsentieren Elektroden auf eine relativ kleine Gruppe von Neuronen in der Nähe 6.
Jedoch komplex Gewebereaktionen ergeben sich aus der langfristigen Implantation durchdringenden MEAs, was häufig in variablen und allmählich Vermindern elektrophysiologischen Signal-zu-Rausch-Verhältnissen über Tage bis Monate, und ein Anstieg der elektrischen ImpedanzGleichgewicht zwischen Elektrode Seiten und Boden 7,8. Die putativen Ursprünge dieser Änderungen umfassen die Aktivierung der Mikroglia, reaktive Astrozytose entlang der Mikrovorrichtungen, und einen Verlust oder Migration von Neuronen aus dem umgebenden Gewebe zu implantierenden Vorrichtungen 9-11. Eine große Herausforderung für das Verständnis dieser Gewebsveränderungen um chronische, Penetration MEAs ist die Schwierigkeit bei der Erfassung von histologischen Daten des intakten Gewebes Schnittstelle umliegenden chronisch implantierten Geräten 12. Die histologische Analyse des Gewebes mit dem Gerät / Gewebe-Grenzfläche noch vorhanden wäre auf die aktuellen Geräte-removal histologischen Protokolle verbessern. Vorrichtung mit einer ungestörten restlichen im Gewebe konnte die biologische Wirkung von relativ feinen Wechselwirkungen, wie zB die Verwendung von biokompatiblen Beschichtungen 13,14 oder dem elektrischen Löschen der Elektrodenoberfläche 15,16, abgebildet und analysiert werden in Bezug auf das Implantat.
Here zeigen wir eine Methode, um zu sammeln, zu verarbeiten und Bild der intakten Kleinstgerätes Schnittstelle für detaillierte Mikroskopie-basierte Analyse des umgebenden Hirngewebes. In diesem Verfahren werden die Vorrichtung und umgebende Hirngewebe in einem dicken (> 250 um) Gewebeschnitt mit einem Vibratom gesammelt. Etikett zur histologischen Eindringen in diesen dicken Scheiben zu verbessern, sind fluoreszierende histochemische und immunhistochemische Etiketten in hohen Konzentrationen in Lösungen enthaltend Blockierserum und Spülmittel für mehrere Tage aufgetragen. Optisches Clearinglösung eingesetzt wird, um Mikroskopie Tiefen zu verbessern, und das Gewebe wird im 2-seitigen Kammern für nachfolgende Laserscanning Konfokalmikroskopie 17 montiert. Um den vollen histologischen Schnittstelle zu erfassen, wird eine computergesteuerte translationale Stufe während der Bildgebung verwendet werden, um Z-Stapel Panoramen entlang der Länge der Implantate zu sammeln. Neben Bildgebung angewendet Gewebe Etiketten, Sammeln Laser Reflexion zurück von Implantatenund die Übertragung von Licht durch das Gewebe sowohl bei der Lokalisierung des Geräts Schnittstelle in Bezug auf das umliegende Gewebe. Tissue unter Verwendung dieses "Device-Capture Histologie" (DCHist Protocol) bietet Imaging Zugang zu den morphologisch konservierten Gewebe / Vorrichtungs-Interaktionen und damit eine Verbesserung gegenüber vorherigen Gerät-removal histologischen Protokolle 18.
Der "Device-Capture Histologie" (DCHist)-Methode hier gezeigt ermöglicht die enge histologische Beurteilung der morphologisch konservierten Wechselwirkungen zwischen Hirngewebe und Gewebeimplantate. DCHist Gewebesammelbeutel erfordert eine sorgfältige Trennung der Schädel-Mounted-Device-Komponenten von den Komponenten im Gehirn implantiert. DCHist erfordert auch Sammlung von einer dicken histologischen Gewebeschnitt (> 250 um). Diese Gewebeschnitten, einmal markiert, gelöscht, montiert und abgebildet werden, können neue Einblicke in die Implantation Verletzungen oder Folge einer chronischen Reaktion auf innewohnende Geräte bieten. Mit Hilfe modernster Mikroskopie-Tools, kann die Schnittstelle zwischen Gewebe und Gerät abgebildet und analysiert werden in hohen Details, wie in den Abbildungen 3-5 dargestellt.
Die vorgestellten Techniken in ihrer derzeitigen Form beruhen auf der Fähigkeit, langsam graben sich die Kopfhaube aus zwei Teilen Zahnzement und Kwik-Sil bis zu dem Punkt des Gerätes Implantation.Verwendung Dentalzement die weg gebrannt werden kann oder auf andere Weise entfernt und eine klare Silikonelastomer durch welche kleine Schere geführt optisch stark in erfolgreich Abtrennen der implantierten Vorrichtung aus dem Schädel-mounted-Komponenten unterstützen kann. Der Versuch, das Gerät unter dem Schädel und das Gehirn über geschnitten, um es in situ zu sammeln ist nicht empfehlenswert, da der Schädel montierte Implantat heraus wird im Gehirn eine signifikante Menge abgezogen werden.
Obwohl dünner, kleiner Implantate, wie einzelne Schaft MEAs aus NeuroNexus Technologies, am ehesten zugänglich zu DCHist sind, werden die Prinzipien nicht auf einzelne Geräte Schäfte oder Mikroelektroden-Arrays beschränkt. Sammlung und Imaging-Strategien sind breit anwendbar zu Multi-Schaft Geräte und größere Implantate wie Kanülen, mit den Anforderungen ist, dass sie von jedem Schädel Halterung getrennt werden gesammelt und in einem dicken Gewebeschnitt. Obwohl die Autoren sich auf die Analyse von Gewebe konzentriertumgebenden kortikalen Implantate könnten Geräte tiefer in das Gehirn getrieben ebenfalls gesammelt und abgebildet werden. Die Tiefe der Implantation sollte nicht die Erfassung des Implantats in einer Scheibe vorgesehen das Gerät nicht wild abweichend zur bekannten Winkel Einschubrichtung.
Einschränkungen existieren, um die nützliche Anwendung der DCHist Methode. Hirngewebe Abschnitte sind image Herausforderung durch Hunderte von Mikrometern, insbesondere in den Bereichen der weißen Substanz, obwohl optische Clearing-Lösungen erheblich verbessern kann imaging Tiefen in verschiedenen Geweben 21. Zur weiteren Verbesserung Abbildungstiefe kann Zweiphotonenanregung Mikroskopie zusammen mit dem optischen Lichtung beschrieben eingesetzt werden.
Eine weitere mögliche Einschränkung des beschriebenen Verfahrens lassen sich die spezifische fluoreszierende Immunohistochemie Methoden und Antikörper durch Forscher entsprechend eingesetzt werden. Passive Diffusion in der Regel treibt die Integration dieser Marker durch feste Gewebeund auf Antigen-Bindungsstellen. Fertigen Antikörper Arbeiten Konzentrationen müssen die Forscher auf einer von Fall zu Fall zu kennzeichnen Eindringen zu maximieren bei gleichzeitiger Vermeidung hoher Hintergrund Kennzeichnung festgelegt werden. Antikörpermarkierung sollte nicht variabel zwischen Scheiben, die identisch verarbeitet werden, aber verschiedene Antikörper können beträchtlich variieren in ihrer Fähigkeit, zu durchdringen und zu markieren ihr Antigen, wobei einige Antikörper leicht Etikettieren Antigene viele hundert Mikrometer tief und andere Markierungen Antigene nur zehn Mikrometer tief. Wir beschreiben die Verbesserung dieser Diffusion durch Anlegen Antikörper markiert bei höheren Konzentrationen als typische, für mehrere Tage der Applikation, und in einer Lösung, die verdünnte Reinigungsmittel und Blockierserum. Periodisch Spiegeln die Scheiben fördert auch noch die Etikettierung. Antigenwiedergewinnung Schritte und alternative Fixierung Prozesse (zB Glutaraldehyd, Mikrowellen etc.) geeignet sein für spezifische Antigene. Sekundärantikörper-fluorochrom Konjugate können auch in ihrer Leistung Kennzeichnung dicke Schnitte variieren, obwohl dies von den Autoren nicht mit Alexa Fluor Etiketten von Invitrogen beobachtet worden. Alternativ kann transgenes Tier exprimieren Probanden fluoreszierenden Proteine in den Zelltypen von Interesse verwendet werden, um Probleme mit Antikörpermarkierung Penetration zu vermeiden, da viele fluoreszierende Proteine wie eGFP, behalten ihre Fluoreszenz nach Formaldehyd-Behandlung, und kann unmittelbar visualisiert Gewebeschnitten.
DCHist ist eine leistungsfähige Reihe von Techniken zur Erfassung und Analyse der Auswirkungen von implantierten Microdevices an Hirngewebe. Kopplung dieser histologischen Protokoll mit in vivo Beurteilung der Elektrophysiologie Qualität und Elektrodenimpedanz Daten 22 könnte erheblich verbessern unser Verständnis der biologischen Quellen der Physiologie Variabilität und Abbau. Der Bereich der implantierten neuronalen Prothesen kann insbesondere aus der ausführlichen DCHist ima profitierenGing der intakten Gerät / Gewebe-Grenzfläche zur Weiterentwicklung der biologisch neutral MEA-Geräte informieren.
The authors have nothing to disclose.
Alle Experimente wurden unter der Aufsicht der Purdue Animal Care und Use Committee und dem Laboratory Animal Program an der Purdue University durchgeführt.
Diese Arbeit wurde von der Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) Microsystems Technology Office (MTO), unter der Schirmherrschaft von Dr. Jack W. Judy (jack.judy @ darpa.mil) als Teil des Reliable Neural Technology Program gesponsert durch das Space and Naval Warfare Systems Command (SPAWAR) Systems Center (SSC) Pacific Grant No N66001-11-1-4013.
Die Autoren bedanken sich bei Mikhail Slipchenko, Don Ready, Greg Richter, Aaron Taylor und Kevin Eliceiri für den Austausch ihrer Mikroskopie Expertise danken.
Reagents | |||
Hoechst 33342 | Invitrogen | 14533 | DNA marker |
Rabbit anti-Iba1 | Wako (Japan) | 019-19741 | Monocyte antibody |
Dental acrylic | Lang Dental (various distributors) | Jet Denture Repair Powder & Liquid | Headcap construction |
Kwik-Sil | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Covering exposed cranial implants |
Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | Tissue processing |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | Tissue processing |
Urea | Sigma-Aldrich | U4883 | Clearing solution |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G20225 | Clearing solution |
Equipment | |||
Curved micro-scissors | World Precision Instruments | 14208 | Cutting implant before removing brain |
Razor blades | Ted Pella | (various sizes) | For use with Brain Block |
Acrylic Brain Matrice | Ted Pella | 15054 | Brain Block to create initial plane in tissue |
Plastic slides | Ted Pella | 260225 | Mounting tissue |
Cover glass | Ted Pella | (various sizes) | Mounting tissue |
Electrode arrays | NeuroNexus Technologies | (various designs) | Example MEAs |
Vibratome | Leica | VT1000 S | Specific system used in presented method |
Vibratome blades | (various suppliers) | Collecting slices | |
24-well plates | (various suppliers) | Storing and processing tissue slices | |
Confocal microscope with motorized XY-scanning stage | Carl Zeiss Microscopy | Zeiss LSM 710 and ‘Zen 2010’ software | Specific system used in presented method |
Soldering iron | (various suppliers) | Excavating headcap |