Intact Histologische Karakterisering van Brain-geïmplanteerde Microdevices en het omringende weefsel

Oplossingen Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) – in g / l, 9 g NaCl, 0,144 g KH 2PO 4, 0,795 g Na 2 HPO 4, bij pH 7,4 4% Formaldehyde – in ml / l; 202 ml dibasisch oplossing (0,4 M Na 2 HPO 4), 48 ml monobasisch natriumfosfaat-oplossing (0,4 M NaH 2 PO 4), 500 ml 8% formaldehyde-oplossing, 250 ml Milli- Q water ddl, bij pH 7,4 HEPES gebufferde Hank's Saline met natriumazide (HBHS) – in g / l; 7,5 g NaCl, 0,3 g KCl, 0,06 g KH 2PO 4, 0,13 g Na 2 HPO 4, 2 g glucose, 2,4 g HEPES, 0,05 g MgCl2 6 delen H2O, 0,05 g MgSO 4 7 delen H 2 O, 0,165 g CaCl2, 0,09 g NaN3 bij pH 7,4 Wash Solution (WS) – 1% vol / vol, ook nietmal Goat Serum, 0,3% Triton X-100, in HBHS met natriumazide (NaN3). Koel het WS bij 4 ° C voor gebruik in daaropvolgende stappen. U2 Sca l e Solution – 4 M ureum, 30% glycerol en 0,1% Triton X-100 17 PROCEDURE Alle experimenten werden uitgevoerd onder toezicht van de Purdue Animal Care en gebruik Comite en het Laboratory Animal Program aan de Purdue University. 1. Chirurgie Verschillende aseptische chirurgische methoden verenigbaar zijn met de gepresenteerde histologische methode. Het gebruik van een stereotactische frame en geautomatiseerde inbrengers wordt aanbevolen om reproduceerbaarheid en controle van de micro-elektrode arrays (MEA) implantatie hoek verbeteren met betrekking tot stereotaxische vlakken. Opmerking: In deze demonstratie onze chirurgische methode is als volgt: houd de knaagdier onderwerp in stereotaxisch earbars while onder isofluraan anesthesie (tussen 1-3%), uitgevoerd door medische kwaliteit zuurstof. Test voor het ontbreken van een toe-pinch weerspiegelen in de rat of het ontbreken van een staart pinch reflex in de muis te bevestigen dat het dier volledig verdoofd. Breng oogzalf en reinig de chirurgische site met drie afwisselende wasbeurten van Betadine en ethanol. Was handen, dageraad chirurgische handschoenen, haarnetje, gezichtsmasker en toga. Injecteer een bolus van lidocaïne op de chirurgische te verdoven, een incisie met een schaar of een scalpel, duidelijke periost met been schraper en katoen applicators te creëren, en een craniotomie met behulp van een tandheelkundige boor handstuk en boor te creëren. Rijd een single-schacht MEA in de cortex met behulp van een micromanipulator. Heb een chirurgische assistent hulp bij het handhaven van aseptische chirurgie voorwaarden en documenteren het verloop van de operatie. Na implantatie van de MEA in de hersenen, beelden verzamelen door een chirurgische microscoop om de uiteindelijke verwijdering van de schedel hoogte van rond de bregen. Geïmplanteerde delen van de apparaten worden bewaard in situ. Opmerking: De uiteindelijke verzameling van weefsel met in situ apparaten gebaseerd op dicht aansluit bij het ​​vlak van inrichting insertie met het vlak van weefsel coupes. Gedetailleerde aantekeningen over het apparaat inbrengen vliegtuig ten opzichte van de hersenen zijn dus erg belangrijk. Na implantatie, breng het silicone elastomeer Kwik-Sil (WPI), rond een bloot MEA schachten of bekabeling, en laten uitharden. Een gesteriliseerd plastic stuk, zoals een snee pipetpunt, kan worden gebruikt om de silicone-elastomeer bevatten in een klein putje in de craniotomie het uitharden. Breng een laag van twee-delige tandheelkundige acryl ("Jet Liquid" en "Jet Powder" van Lang Dental) over de Kwik-Sil en blootgestelde schedel. Opmerking: In een latere stap wordt de headcap worden gesmolten door om het implantaat te scheidenvan de schedel. UV-uithardende acryl worden vermeden gedurende de Kwik-Sil en craniotomie, aangezien dit zeer moeilijk acryl is later moeilijk te verwijderen. Visueel ondoorzichtige materialen rondom het implantaat moet ook worden vermeden; duidelijke Kwik-Sil geeft een beeld van het implantaat tijdens de volgende stappen van dit protocol. Post-operatieve zorg procedures volgens het lokale protocol van het welzijn van dieren regelgeving, en terug te keren ambulante patiënten met single-gehuisvest kooi-dozen. 2. Perfusie en Tissue Collection Opmerking: Zie Gage et al.. voor een gedetailleerde perfusie procedure walkthrough bij de rat diermodel 19. Gebruik de anesthesie en perfusie protocol goedgekeurd door dier van de instelling zorg en gebruik comite. Na diep verlamming van de knaagdieren (bevestigd door een gebrek aan toe-snuifje reflex in ratten of staart-snuifje reflex bij muizen) en het blootstellen van het hart, maken ondiepe schaar bezuinigingen opde linkerventrikel en rechter atrium. Plaats een stompe naald in de linker ventrikel en leveren kamertemperatuur PBS. Leveren in totaal ongeveer 10 ml PBS bij ~ 5 ml / min in muizen en ~ 200 ml PBS bij ~ 100 ml / min bij ratten. Kijk voor het bloed te zuiveren van de lever tijdens. Transcardiaal injecteren histologisch relevante chemische labels, indien gewenst, door spuit productietijd met zorg te voorkomen dat er luchtbellen. Opmerking: Vasculaire labels (bijv. DiI) en nucleïnezuur tegenkleuring kleurstoffen (bijvoorbeeld Hoechst 33342) zijn voorbeelden van chemische labels leverbaar tijdens perfusie. Bij een juiste toediening, moeten deze histologische markers label het hele dier 20. Lever gebufferd, kamertemperatuur, 4% formaldehyde transcardiaal om het dier op te lossen. Vermijd septum perforatie over het hart, die kan door long-nose drainage worden aangetoond tijdens de perfusie. Kijk voor fixatie trillingen in de grote spierenvolledige perfusie geven. Leveren in totaal ~ 10 ml fixeermiddel bij ~ 5 ml / min in muizen en ~ 200 ml fixeermiddel bij ~ 100 ml / min bij ratten. Na perfusie onthoofden het dier bloot deel van de hersenstam of cerebellum met rongeurs of schaar en place kop in 4% formaldehyde oplossing overnacht bij 4 ° C. Was de kop in drie veranderingen van PBS met een tot vier uur intervallen tussen wasbeurten. Bewaar vaste koppen in HBHS bevattende natriumazide bij 4 ° C gedurende dagen tot maanden. 3. Brain verwijderen met in situ apparaten Opmerking: Voer deze sectie in een zuurkast tijdens het dragen van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen. Vermijd weefsel uitdroging door terugzending van de vaste kop om periodiek HBHS oplossing. Voorzichtig ontleden weg huid en andere weefsels uit de hele acryl schedelkap behulp van een tang en een kleine schaar. Terwijl het dragen van warmte-insensitive handschoenen, gebruik maken van een soldeerbout om tandheelkundige acryl te verwijderen en een oppervlakte van ten grondslag liggen aan duidelijke Kwik-Sil (figuur 2a) bloot te leggen. Opmerking: Het doel van deze stap is om micro-schaar een geschikte hoek toegang tot posities waar de geïmplanteerde apparaten in de hersenen, waardoor de hersenen geïmplanteerde componenten worden gescheiden van componenten bevestigd aan de schedel. Onder een chirurgische microscoop, gesneden in de silicone-elastomeer met gebogen micro-schaar, het verwijderen van kleine stukjes Kwik-Sil met een pincet naar de positie waar de inrichtingen in de hersenen. Verder zagen langs het oppervlak van de craniotomie met gebogen micro-schaar afzonderlijk apparaat onderdelen die aan polysilicium en schedel van componenten in de hersenen geïmplanteerd. Opnieuw te gebruiken microscoop vergroting en grote zorg bij het snijden door middel van de blootgestelde onderdelen van het systeem en zorg ervoor om te voorkomen dat duwen of slepen van de implanten in de vaste weefsel. Verwijder het bot rond de headcap met zorg met behulp van rongeurs. Gebruik een spatel om de hersenen te scheiden met geïmplanteerde apparaten van de schedel. Bewaar de hersenen in HBHS oplossing totdat klaar om te snijden. Plaats de hersenen in een glazen petrischaal gevuld met HBHS en met een scheermesje om vreemde weefsel te verwijderen, zoals ruggenmerg, cerebellum of bulbus olfactorius, naargelang zij relevant zijn voor de locatie van de implantatie. Gebruik hersenen blokkeren (Ted Pella) en scheermesjes punt de hersenen en een plat vlak nauw overeenkomt met de hoek van de geïmplanteerde apparaten, dit wordt bereikt door het brein in een geschikte grootte brain blok oriënteren de hersenen, dat zichtbare gedeelte van het implantaat is parallel met het scheermesje gids en plaatsen van een scheermesje in een bladgeleiding ten minste 2 mm van het implantaat. Op het scheermes door het weefsel. Monteer dit oppervlak tot een vibratome platform. Alternalijk, een scheermesje gemonteerd op een micromanipulator kan worden gebruikt in een soortgelijke manier als de controle hersenen blok een vlak nauw overeenkomt met de richting van het implantaat te creëren. Plek ijs onder de vibratome platform en, nadat men de weefseloppervlak kort drogen op een papieren handdoek, de hersenen zich aan een vibratome met Super Glue. Lijm het platte vlak weefsel aangemaakt in de vorige stap is naar het podium. Met asymmetrische weefsel afmetingen, oriënteren de steekproef zodanig dat de breedste afmeting is gelijmd parallel naar beneden met de bewegingsrichting van de vibratome blad om te helpen voorkomen dat het blad potentieel kloppen het weefsel over. Nadat de lijm sets (~ 1-2 min), voeg gekoeld (~ 4 ° C) PBS vibratome de schaal rond het weefsel. Verzamel dikke weefselcoupes tussen 200-400 pm, met inbegrip van controle weefsel, met de maximale trillingssnelheid (~ 100 Hz) en een langzame mes progressie (<0,2 mm per seconde), met een blad hoek van 10 ° van horizontal. Zorgvuldig verzamelen plakken met een borstel of spatel schep en op te slaan in HBHS in een 24 wells plaat bij 4 ° C. Zodra het in situ apparaat zichtbaar met het blote oog of een chirurgische microscoop verzamelen dunnere secties van het apparaat benaderen slice stappen van 100 urn of minder. Opmerking: Typische micromachining implantaten zichtbaar met het blote oog in formaldehyde gefixeerde knaagdier cerebrale cortex weefsel tussen 300 en 500 urn van het apparaat oppervlak. Met de in situ apparaat nu dicht bij het ​​oppervlak van het weefsel, verzamel a> 250 urn weefsel slice met het apparaat binnen. Schatting van de noodzakelijke dikte kan worden ondersteund door verwijzing eerder verzamelde plakjes. Opmerking: Grotere apparaten, meertands apparaten en schuine apparaten vereisen dikker weefsel plakjes (> 500 um) om het apparaat vast te leggen in een stuk weefsel; relid dat zowel de penetratie van de toegepaste labels en de microscopie beeldvorming diepte zal worden beperkt in de uiteindelijke dataverzameling van deze zeer dikke plakken. Indien mogelijk, vermijd het slaan van de inrichting met de vibratome mes, omdat dit kan leiden tot het slepen van het apparaat door het weefsel en morfologische vervorming. 4. Tissue Verwerking en Clearing Was de plakjes 3x op 5 min per wasbeurt in HBHS Incubeer in natriumboorhydride (5 mg NaBH4 / 1 ml van HBHS) gedurende 30 min totale (15 min elke zijde van het segment). Draai de plakjes met behulp van een roestvrij staal of teflon gecoat micro lepel en kleine penseel (Ted Pella). Langzaam en bedachtzaam bewegingen verbeteren van het succes van elke plak flip. Vermijd het aanraken van alle gebieden rond de geïmplanteerde apparaat met de borstel. Indien mogelijk, het toevoegen van aanzienlijk meer oplossing dan nodig is (> 2 ml) maakt het mogelijk om te manipuleren en klap de weefselcoupes gemakkelijker. <p class="jove_content"> Opmerking: Deze stap endogene vermindert autofluorescentie; deze stap overslaan als fluorescerende labels werden toegepast tijdens perfusie of XFP transgene markers aanwezig zijn. Was 3x plakken op 5 min per wasbeurt in wasoplossing bij kamertemperatuur. Opmerking: Agitatie tijdens het wassen en incubatiestappen is optioneel. De auteurs speculeren dat subtiele stoten van de stijve implantaat ten opzichte van het omringende hersenweefsel kan optreden onder roeren. Echter, een orbital mixer beweegt met een zachte snelheid (<60 rpm) vermijden en tegelijk de beweging van oplossingen. blokkeren 2 uur in wasoplossing bij kamertemperatuur (flip plakken na een uur). incubeer primaire antilichamen (verdund wasoplossing) gedurende ongeveer 48 (24 aan elke kant het deel) 4 ° c. voer 6 snelle 3 minuten wassen met wash solution. 6, 1 (3 washes weefsel slice) (bewaar c indien nachts). secundaire per kant) wasbeurten wasoplossing, bewaar of overnacht wassen. verwijder voeg glycerol-based "u2 – sca l e" clearing oplossing. laat week duidelijk voor dikke (250-500 um) 2-3 weken zeer coupes (> 500 um) bij 4 ° C. Afdekplaat met folie en bewaar bij 4 ° C. Monteer in dia's opvang dikke coupes (Figuur 2b, 2c) met behulp van clearing oplossing als de montage media en afdichten met duidelijke nagellak. Bewaren bij 4 ° C buiten invloed van licht. 5. Panorama Imaging van Full Tissue en Device Interface Met behulp van langere werkafstand microscoop doelstellingen (> 2 mm), beginnen beeldvorming met een laser scanning confocale microscoop of 2-foton microscoop. We zullen aantonen met een Zeiss LSM 710, Carl Zeiss "Zen"-software (2010), en een computer-gestuurde XY vertalen podium om het imago van een 3D-panorama rondom een ​​implantaat. Opmerking: Correcte de brekingsindex van de clearing oplossing ofwel in software, door een corrigerende kraag op het doel of in gegevensverwerkende na collectie. In deze demonstratie gaan we een brekingsindex waarde voor de "U2" clearing oplossing van 1,4 in de Leica Zen microscoop software; deze instelling subtiel past z-stappen van om rekening te houden brekingsindex mismatch. In weefsel bij het apparaat ongeveer het passende z-as venster en gegevensverzameling instellingen in de z-afmeting van elk kanaal met fluorescerende laag laservermogen (~ 00,5 tot 5%) en grote z-stapgrootte (> 25 pm). Opmerking: aanvullende ruimte boven en onder het instellen van de z-as bij het ​​opzetten voor panoramische gegevensverzameling, het weefsel niet volledig vlak op de objecthouder (~ 20 urn elke richting). Stel de doelstelling op het xy centrum van je uiteindelijke panorama, het gebruik van de Zen panorama-software, bepalen het aantal collectie posities die nodig is voor elke as (x en y) voor uw regio van belang zijn. Opnieuw te evalueren en afronding van de z-as collectie venster. Handmatig de detector gevoeligheid en laservermogen adequaat opvoeren met grotere diepte, het doel is typisch ongeveer handhaven hetzelfde beeld intensiteit ongeacht imaging diepte in het weefsel slice, maar ook voorkomen hoge achtergrondruisniveaus. Verzamel elke fluorescerende beeldgegevens serie. Indien nodig om te voorkomen dat overlappende signalen, voert laserlijns sequentieel. Opmerking: Indien beschikbaar, moet u de software voor het automatisch opslaan van gegevens op de harde schijf tijdens het verzamelen. Verander de software-instellingen om de "reflectie" en "transmissie" gegevens te verzamelen, en gebruik een langere, meer penetrerende golflengte laser (bijv. 633 nm) om deze kanalen vast te leggen. Bepaal de juiste laservermogen en gevoeligheid van de melder voor "reflectie" en "transmissie" collectie en herhaal dezelfde collectie serie rond het geïmplanteerde apparaat. Exporteer de gegevens voor latere verwerking, kwantificering en analyse.