脑植入的微型器件及周围组织的完整的组织学特性研究

解决方案 磷酸盐缓冲液（PBS） -以g / l; 9克NaCl，0.144克KH 2 PO 4，的0.795克Na 2 HPO 4，在pH 7.4 4％甲醛 -毫升/升;202毫升钠磷酸氢二钠溶液（0.4M的Na 2 HPO 4），48毫升磷酸二氢钠溶液（0.4M的NaH 2 PO 4），500毫升8％的甲醛溶液，加入250毫升纯水Q DDI水，在pH = 7.4 HEPES缓冲Hank氏盐渍钠叠氮化物（HBHS） -以g / l，7.5克氯化钠，0.3克氯化钾，0.06克KH 2 PO 4，0.13克的Na 2 HPO 4，2克葡萄糖，2.4克的HEPES，0.05克的MgCl 2 6份H 2 O，0.05克MgSO 4 7份H 2 O，0.165，0.09克NaN的3，在pH 7.4克CaCl 2 洗涤液（WS） – 1％体积/体积，也正常山羊血清，0.3％的Triton X-100，用叠氮化钠（NaN 3）中的HBHS。冷藏WS，在4℃，然后在随后的步骤中使用。 U2 SCA L E解决方案 – 4 M尿素，30％甘油和0.1％的Triton X-100的17 程序所有的实验都普渡大学的动物管理和使用委员会及计划在美国普渡大学实验动物的监督下进行。 1。手术各种无菌外科手术的方法是兼容的组织学方法。立体定位框架的使用和自动插入器建议改善重现性和控制的微电极阵列（MEA）的注入角度相对于立体定向平面。 注：在这个演示中，我们的手术方法如下：持有的啮齿动物的whIL在立体earbars的主题。e在异氟醚麻醉（1-3％之间）进行的医疗级氧气。缺乏一个脚趾捏试验反映在大鼠或缺乏在鼠标的尾部掐反射确认该动物是完全麻醉。涂抹眼膏，有三个聚维酮碘和乙醇交替洗涤和清洁手术部位。洗净双手，黎明发网，外科手术手套，口罩和隔离衣或防护服。注入静脉推注利多卡因麻醉手术区，创建一个切口，用剪刀或手术刀，明确的骨膜与骨铲土机和棉花喷头，并使用牙钻手机和钻头开颅手术。驱动一个单柄MEA到皮层使用显微操作。有一个手术助手在保持无菌手术条件的援助，并记录了手术的进展。 植入到大脑的MEA，收集到的图像通过外科手术显微镜通知最终去除的头骨周围的b雨。植入部分的设备将被保留在原位 。 注：最终收集组织原位设备依赖于密切相匹配的平面与平面的组织切片的设备插入。详细记录设备插入平面相对于大脑是非常重要的。 装置植入后，应用有机硅弹性体KWIK-SIL（WPI），任何暴露的MEA柄或电缆周围，让治愈。甲灭菌的塑料片，如切断的移液管尖，也可以使用，以帮助固化，同时，包含在一个小的有机硅弹性体以及周围的开颅。 应用层由两部分组成的牙科丙烯酸（“喷射液体”和“喷粉”郎牙科的）在KWIK-SIL和任何暴露的头骨。 注 ：在后面的步骤中，headcap将被熔化通过允许以被分离的植入物从头骨。 UV固化丙烯酸在佳银和开颅应避免，因为这非常硬丙烯酸是难以除去购买。视不透明材料植入物周围也应避免明确KWIK-SIL的植入提供了一个在本协议的后续步骤。 手术后的护理程序，根据当地的动物福利法规，协议的执行，并返回门诊科目单住的笼箱。 2。灌注和组织收集 注：请参阅Gage等人。在大鼠动物模型19的详细灌注过程演练。 使用麻醉和灌注协议，该机构的动物护理和使用委员会批准。深麻醉后的啮齿类动物（确认缺乏脚趾，捏在大鼠或小鼠的尾巴捏反射的反射）和暴露的心，使的浅剪刀削减左心室和右心房。钝针头插入左心室，并提供室温下PBS。提供一个共〜10毫升PBS〜5毫升/分钟在小鼠和〜200毫升的PBS在〜100 ml / min的大鼠。看的肝脏从血液清除。 注入组织学相关的化学品标签transcardially，如果需要的话，用注射器交付小心谨慎以避免引入气泡。 注：血管标签（DII）和核酸染液的染料（ 如赫斯特33342）交付灌注过程中的化学品标签的例子。如果管理得当，这些组织的标记应标注在整个动物20。 提供缓冲，室温，4％的甲醛transcardially固定动物。避免鼻中隔穿孔整个的心脏，它可以证明的期间肺鼻子排水灌注。固定在大肌肉震颤显示完整的灌注。提供一个共〜10毫升固定液〜5毫升/分钟在小鼠和〜200毫升固定剂在〜100 ml / min的大鼠。 灌注后，杀头的动物，用咬骨钳或剪刀，头放入4％甲醛溶液中过夜，脑干或小脑的一部分暴露在4°C 一至四个小时洗涤液之间的间隔，在三个转变的PBS洗净头部。 将固定磁头HBHS叠氮化钠在4°C为几天到几个月。 3。脑去除原位设备 注：执行本节在通风橱中，而穿着适当的个人防护装备。在返回固定头，定期HBHS解决方案避免组织干燥。 各地丙烯酸头盖骨使用钳子和小剪刀，小心地剖析了皮肤和其他组织。 虽然穿着热我nsensitive手套，使用电烙铁，清除牙丙烯酸和公开区基本明确KWIK-SIL（ 图2a）。 注意：此步骤的目的是允许微剪刀访问植入设备的位置处进入大脑的一个适当的角度，从而使脑植入的元件可能是分离的组件固定在颅骨上。 在手术显微镜下，有机硅弹性体具有弯曲的微剪刀切成，用镊子除去小块佳实向下的位置时，器件进入大脑。 继续沿着弯曲的微型剪刀单独的设备组件，多晶硅和颅骨植入大脑中的组件开颅手术的表面切割。通过公开的设备组件再次使用显微镜的放大倍率和切割时非常谨慎，小心，以避免推动或拖动小鬼lants在固定的组织。 去除骨周围的headcap小心用咬骨钳。用铲子分离的大脑植入设备的头骨。店的解决方案在HBHS的大脑，直到准备好切。 将大脑充满HBHS在玻璃培养皿中，并用剃刀刀片删除多余的组织，如脊髓，小脑，或嗅球，这取决于它们是否是相关的位置的装置植入。使用的脑块（泰德培拉）和刀片部大脑和密切匹配的角度植入设备建立一个平面，这是通过在一个大小合适的脑块放置大脑，大脑这样，任何取向可见部分的植入物是平行刀片指南，和放置在一个刀片导向从植入物的至少2毫米的剃刀刀片。按刀片穿过组织。安装这面到vibratome平台。或者为剃刀刀片安装在显微操作作为大脑块创建密切匹配的植入物的方向的平面内，可以用在类似的控制的方式。 将冰下vibratome平台中，使组织表面简单的纸巾上干燥后，坚持到vibratome使用超级胶水的大脑。胶在上一步中创建的扁平组织平面的舞台。具有非对称的组织尺寸，取向等的样品被粘下来的vibratome刀片的移动方向，以帮助避免可能敲组织超过刀片平行的最宽尺寸。胶水集后（约1-2分钟），添加冷藏（〜4℃）的PBS组织周围的vibratome菜。 收藏报错厚200-400微米之间，包括控制组织的组织切片，用刀片从浩角为10°，使用的最大振动速度（〜100赫兹）和一个缓慢的叶片进展率（<0.2毫米每秒）rizontal。小心地用刷子或铲子铲和商店在HBHS在24孔板收集切片在4°C。 一旦原位的移动设备的肉眼或手术显微镜可见，收集较薄的部分接近100微米或更小的增量，在分片的移动设备。 注：典型的硅微植入物是在甲醛固定的啮齿动物大脑皮层组织300和500微米之间的从设备表面用肉眼可见。 随着原位设备，现在已经接近表面的组织，收集> 250μm的组织切片内的设备。必要的厚度估计可以辅助通过引用以前收集的切片。 注：大型设备，multishank设备和角度的设备可能需要更厚的组织切片（> 500微米）捕捉到的设备在一个组织块重新成员应用标签的渗透和显微成像深度将是有限的，在最后的数据收集这些很厚的片。如果可能的话，应避免撞击装置的vibratome刀片，因为这可能会导致拖动设备通过组织和形态的变形。 4。组织处理及结算所洗净切片，3倍于每洗5分钟HBHS 孵育在硼氢化钠（5毫克加入NaBH 4/1毫升HBHS）总共为30分钟（15分钟的每一侧的切片）。翻转片，采用不锈钢或聚四氟乙烯涂层的微勺子，小画笔（特德·佩拉）。动作速度慢和周到的提高，每片翻转的成功。避免接触的任何区域周围的植入装置用刷子。在可能的情况下，将越来越多的解决方案需要（2毫升），允许一个组织切片更容易操作和翻转。 <p class="jove_content"> 注意：此步骤，减少内源性自发荧光;如果采用荧光标记灌注过程中，或XFP转基因标记是跳过此步骤。 在洗涤液：在室温下洗涤​​5分钟，每片3倍洗净。 注：搅拌过程中清洗和培养步骤是可选的。研究人员推测，微妙的生硬植入物与周围的脑组织，可能会出现不和谐的搅拌。然而，在温和的速率（<60转）移动一个轨道混合器可避免这种情况的解决方案，同时增加的移动。 座冲洗缓冲液中2小时，在室温下（1小时后）倒装片。 初级抗体（冲洗缓冲液中稀释）孵育约48小时（24小时，每一侧上的切片），在4℃下执行6快3分钟的清洗液清洗。 执行6 1小时，洗涤（3洗涤上课冲洗缓冲液中的每一侧上的组织切片）（储存于4℃下如果洗衣机过夜）。 在4°C的二抗（用清洗液稀释）孵育约48小时（24小时每边一个） 执行6快3分钟的清洗液清洗。 执行，1小时洗（每边洗3次），清洗液储存于4°C如果洗涤隔夜。 删除洗涤液，并添加甘油为基础的“U2 – SCA L E”结算解决方案。允许对于非常厚的组织切片（> 500微米）厚的片（250-500微米）或2-3周清除约1周，在4℃下覆盖板带箔和存储在4°C。 安装在幻灯片容纳厚的组织切片（ 图2b，2c）的结算解决方案安装介质和密封透明指甲油。在4°C避光保存。 5。全景成像的全钛ssue和设备接口使用较长的工作距离物镜（> 2毫米），开始用激光扫描共聚焦显微镜或双光子显微镜成像。我们将展示一个蔡司LSM 710，卡尔·蔡司“禅”软件（2010），和一个计算机控制的XY转换阶段植入物周围的3D全景图像。 注意：正确结算解决方案，无论是在软件，通过纠正领上的目标的折射率，或在采集后的处理的数据。在这个演示中，我们进入了一个“U2”结算解决方案，徕卡的禅显微镜软件到1.4折射率值，此设定巧妙地调整Z-步的时间间隔折射率不匹配。 在装置附近的组织，大致评估相应的z轴的窗口，并在z维度上的数据收集设置为每个荧光通道使用低激光功率（〜00.5〜5％）和较大的z步骤大小（> 25微米）。 注：包括额外的空间的上方和下方，当设定z轴时，设立为全景数据收集，作为组织可能不会完全位于平面上的载玻片（〜20μm的每个方向）。 在XY中心最终的全景;使用Zen全景软件所设定的目标，确定收集需要为每个轴（X和Y），以支付您感兴趣的区域的位置。 重新评估和完成的z轴的采集窗口。 手动设置的检测器的灵敏度和激光功率斜坡适当增加深度的目的通常是维持大致相同的图像强度无论成像深度进入组织切片，但也避免高背景噪声。 收集每个荧光图像数据系列。如果有必要，以避免重叠信号，运行激光线小号顺序。 注：如果可用，设置软件自动将数据保存到硬盘驱动器在收集过程中。 更改软件设置，以收集的“反射”和“透射比”的数据，并使用较长的，更渗透波长的激光（ 例如 633纳米）捕捉到这些渠道。 “反射”和“透射比”收集和确定合适的激光功率检测器的灵敏度，周围的植入装置重复同样的收藏系列。 导出的数据后处理，量化和分析。