توصيف نسيجية سليمة من الأجهزة بالغة الصغر زرع الدماغ والأنسجة المحيطة بها
Özet
هنا نقدم طريقة لالتقاط النسيجية، ووضع العلامات، وتطهير بصريا، والتصوير في أنسجة المخ واجهة سليمة حول الأجهزة بالغة الصغر مزروع مزمن في أنسجة المخ القوارض. النتائج من التقنيات تشمل هذه الطريقة مفيدة لفهم تأثير مختلف اختراق يزرع في الدماغ على الأنسجة المحيطة بها.
Abstract
البحث في تصميم واستخدام الأجهزة بالغة الصغر زرع المخ، مثل صفائف مسرى مكروي، ويهدف إلى إنتاج أجهزة ذات الصلة سريريا تلك الواجهة مزمنة مع الأنسجة المحيطة الدماغ. ويعتقد الأنسجة المحيطة زرع هذه للرد على وجود الأجهزة على مر الزمن، والذي يتضمن تشكيل "ندبة الدبقية" العازلة حول الأجهزة. ومع ذلك، عادة ما يتم إجراء التحليل النسيجي لهذه التغييرات بعد الأنسجة شرحا الجهاز، في عملية يمكن أن يعطل التشكل من الأنسجة من الاهتمام.
هنا علينا أن نبرهن على بروتوكول التي يتم جمعها القشرية-زرع الأجهزة المحيطة سليمة في نسيج المخ القوارض. ونحن تصف كيفية، مرة واحدة مع perfused مثبت، تتم إزالة العقول وشرائح في مثل هذه الطريقة لتجنب أجهزة شرحا. نحن الخطوط العريضة الفلورسنت وضع العلامات الأجسام المضادة وطرق تبادل المعلومات البصرية مفيدة لإنتاج إعلامي، والأنسجة السميكة حتى الآنالقسم. وأخيرا، علينا أن نبرهن على تركيب وتصوير هذه المقاطع الأنسجة من أجل التحقيق حول واجهة الأجهزة البيولوجية في الدماغ مزروع.
Introduction
مجال البحث neuroprosthetic يهدف إلى مساعدة الأفراد الذين يعانون من إعاقات مختلفة واضطرابات من خلال تجاوز الهياكل المريضة أو التالفة في الجسم عن طريق الجهاز العصبي المركزي تفاعل الأجهزة 1،2. ويمكن استخدام الأجهزة بالغة الصغر زرع المخ، مثل صفائف مسرى مكروي الأطراف، لتسجيل أو تحفيز الدماغ الهياكل، وبالتالي السماح بإنشاء واجهات طويلة الأجل بين الإلكترونيات والأنسجة CNS 3-5. الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف اختراق والأجهزة التي يقودها في أنسجة المخ، تبشر سيما فيما ثنائية الاتجاه واجهات نظرا لقربها الوثيق داخل الأقطاب التي تقدم لمجموعة صغيرة نسبيا من الخلايا العصبية المجاورة 6.
ومع ذلك، معقدة نتيجة الاستجابات من غرس الأنسجة على المدى الطويل من الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف اختراق، مما أدى في كثير من الأحيان في متغير والمهينة تدريجيا نسب الإشارة إلى الضوضاء الكهربية على مدى الأيام إلى شهور، وزيادة في imped الكهربائيةتعصب بين المواقع الكهربائي والأرض 7،8. أصول المفترضة لهذه التغيرات تشمل تفعيل الخلايا الدبقية الصغيرة، كثرة الخلايا النجمية على رد الفعل على طول الأجهزة بالغة الصغر، وفقدان أو هجرة الخلايا العصبية من الأنسجة المحيطة إلى الأجهزة مزروع 9-11. ومن التحديات الرئيسية لفهم هذه التغيرات النسيجية المزمنة حول الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف الاختراق، هو صعوبة في التقاط البيانات النسيجية واجهة الأنسجة المحيطة سليمة الأجهزة مزروع المزمن 12. والتحليل النسيجي لأنسجة الجهاز مع واجهة / الأنسجة لا تزال موجودة على تحسين البروتوكولات الحالية إزالة الجهاز النسيجي. مع جهاز دون عائق المتبقية في الأنسجة، يمكن تصوير الأثر البيولوجي للتفاعلات خفية نسبيا، مثل استخدام الطلاء حيويا 13،14 أو المقاصة الكهربائية من سطح القطب 15،16، وتحليلها فيما يتعلق الزرع.
Hيحرث نحن يبرهن على وجود طريقة لجمع وتجهيز واجهة وصورة microdevice سليمة للتحليل المجهري القائمة المفصلة للأنسجة المخ المحيطة بها. في هذه الطريقة، يتم جمع الجهاز والأنسجة المحيطة الدماغ داخل قسم الأنسجة سميكة (> 250 ميكرون) باستخدام vibratome. لتحسين النسيجية اختراق في هذه التسمية شرائح سميكة، يتم تطبيق الفلورسنت التسميات النسيجية والمناعية في تركيزات عالية في محاليل تحتوي على مصل منع والمنظفات لأيام متعددة. يعمل حل المقاصة البصرية لتحسين التصوير المجهري أعماق، ويتم تحميل الأنسجة في الجانب 2-غرف ليزر متحد البؤر المجهر اللاحقة 17. لالتقاط واجهة كاملة النسيجية، يتم استخدام مرحلة الكمبيوتر التي تسيطر عليها أثناء التصوير متعدية لجمع Z-مكدس الإستعراضات على طول يزرع. بالإضافة إلى تطبيق التسميات النسيج التصوير، وجمع الانعكاس الليزر مرة أخرى من يزرعونقل الضوء من خلال مساعدة كل من الأنسجة تعريب واجهة الجهاز فيما يتعلق الأنسجة المحيطة. أعد استخدام هذا النسيج "جهاز التقاط علم الأنسجة" (DCHist) بروتوكول يوفر الوصول إلى التفاعلات التصوير الأنسجة / جهاز الحفاظ شكليا، ويحسن بالتالي على بروتوكولات جهاز إزالة السابقة النسيجية 18.
Protocol
Representative Results
Discussion
"جهاز التقاط علم الأنسجة" (DCHist) الأسلوب أظهر هنا يمكن من تقييم وثيقة النسيجي للتفاعلات بين الحفاظ شكليا أنسجة المخ وزرع الأنسجة. DCHist جمع الأنسجة يتطلب فصل دقيق للمكونات الجهاز الجمجمة محمولة من عناصر مزروع في الدماغ. DCHist يتطلب أيضا مجموعة من شريحة سميكة الأنسجة النسيجية (> 250 ميكرون). هذه المقاطع الأنسجة، وصفت مرة واحدة، مسح، التي شنت، والمصورة، ويمكن تقديم رؤى جديدة في زرع إصابة مزمنة أو استجابة لاحقة لأجهزة الساكن. باستخدام أدوات متقدمة المجهري، يمكن تصوير واجهة الجهاز وبين الأنسجة وتحليلها بالتفصيل عالية كما هو مبين في الأرقام 3-5.
التقنيات المعروضة في شكلها الحالي تعتمد على القدرة على حفر ببطء بعيدا مترسة الرأس المصنوعة من الاسمنت الأسنان جزئين وكويك سيل لأسفل إلى حد زرع الجهاز.استخدام الاسمنت الأسنان التي يمكن نسخها أو إزالتها بعيدا خلاف ذلك واضحا من خلال المطاط الصناعي السيليكون التي يمكن أن تسترشد مقص صغير بصريا تساعد بشكل كبير في فصل الجهاز بنجاح مزروع من مكونات الجمجمة محمولة على الخمسين. محاولة لقطع الجهاز تحت الجمجمة والدماغ أعلاه من أجل لأنه جمع في الموقع لا ينصح، كما سيتم سحب زرع الجمجمة محمولة من الدماغ كمية كبيرة.
على الرغم من أرق وأصغر حجما يزرع، مثل الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف عرقوب واحدة من تقنيات NeuroNexus، هي الأكثر قابلية لDCHist، لا تقتصر على المبادئ السيقان جهاز واحد أو صفائف مسرى مكروي. جمع واستراتيجيات قابلة للتطبيق على نطاق واسع التصوير لأجهزة متعددة وساق أكبر يزرع مثل القنيات، مع متطلبات يجب أن يجري فصلهم عن أي جبل الجمجمة والتي تم جمعها خلال قسم الأنسجة سميكة. على الرغم من أن الكتاب يركز على تحليل الأنسجةيزرع القشرية المحيطة بها، يمكن أن أجهزة مدفوعة أعمق في الدماغ أيضا يتم جمع وتصوير. يجب عمق الإدراج لن يؤثر على زرع القبض على زرع شريحة في تقديم الجهاز لا تحيد بصورة عشوائية من زاوية معروفة من الإدراج.
القيود موجودة إلى تطبيق مفيد للأسلوب DCHist. أقسام أنسجة المخ تشكل تحديا لصورة من خلال مئات ميكرومتر، وخاصة في مجالات المادة البيضاء، على الرغم من حلول المقاصة البصرية يمكن أن تحسن كثيرا في أعماق التصوير الأنسجة المختلفة 21. لمزيد من تحسين عمق التصوير، قد تكون استخدمت ثنائي الفوتون المجهري الإثارة مع المقاصة البصرية وصفها.
يمكن الحد من إمكانات أخرى الطريقة الموضحة تكون محددة الطرق المناعية والأجسام المضادة المستخدمة الفلورسنت من قبل الباحثين. نشر السلبي يدفع عادة إدماج هذه العلامات من خلال الأنسجة الثابتةوعلى مواقع مستضد ملزمة. يجب تحديد تركيزات النهائي الأجسام المضادة من قبل الباحثين العاملين على أساس كل حالة على حدة لتحقيق أقصى قدر من الاختراق التسمية مع تجنب وضع العلامات مستويات عالية من الخلفية. يجب وضع العلامات الأجسام المضادة لا تكون متغيرة بين شرائح التي يتم معالجتها بشكل مماثل، ولكن الأجسام المضادة مختلفة قد تختلف اختلافا كبيرا في قدرتها على اختراق وعلامة مستضد فيها، مع بعض الأجسام المضادة وصفها بسهولة مستضدات عدة مئات من ميكرومتر العميقة وغيرها وصفها مستضدات عشرات فقط من ميكرومتر عميقة. وصفنا تحسين هذا الانتشار من خلال تطبيق تسميات الأجسام المضادة في تركيزات أعلى من العادية، لأيام متعددة من التطبيق، و. في محلول يحتوي على المنظفات ومنع تمييع الدم التقليب دوري شرائح يعزز أيضا وضع العلامات حتى. قد الخطوات استرجاع مستضد وعمليات التثبيت البديلة (مثل غلوتارالدهيد، والموجات الدقيقة، الخ) تكون مناسبة لمستضدات معينة. الأجسام المضادة الثانوية fluorochقد تقارن روما تختلف أيضا في أدائها وصفها أبواب سميكة، على الرغم من هذا لم يلاحظ من قبل المؤلفين باستخدام اليكسا فلور من التسميات إينفيتروجن. بدلا من ذلك، يمكن استخدام المواد المعدلة وراثيا الحيوانية معربا عن البروتينات الفلورية في أنواع الخلايا التي تهم تجنب المشاكل مع اختراق الأجسام المضادة التسمية، والبروتينات الفلورية كثيرة، مثل EGFP، في الحفاظ على مضان بهم بعد العلاج والفورمالديهايد، وربما يمكن تصور مباشرة في أقسام الأنسجة.
DCHist هو مجموعة قوية من تقنيات التقاط وتحليل أثر على الأجهزة بالغة الصغر زرع أنسجة المخ. يمكن توصيل هذا البروتوكول النسيجي في الجسم الحي مع تقييم جودة البيانات ومقاومة الكهربية الكهربائي 22 تحسن كثيرا فهمنا للمصادر البيولوجية تقلب علم وظائف الأعضاء وتدهورها. قد مجال زرع الأجهزة التعويضية العصبية على وجه الخصوص الاستفادة من معهد العالم العربي DCHist مفصلةجينج من واجهة الجهاز / الأنسجة سليمة لإعلام مواصلة تطوير الأجهزة MEA محايدة من الناحية البيولوجية.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد أجريت جميع التجارب تحت إشراف ورعاية الحيوان واللجنة بوردو الاستخدام وبرنامج الحيوان المعملية في جامعة بوردو.
وقد رعت هذا العمل من قبل المتقدم الدفاع كالة مشاريع البحوث (DARPA) مايكروسيستمز تكنولوجيا المكاتب (MTO)، تحت رعاية الدكتور جورج جودي جاك (jack.judy @ darpa.mil) كجزء من برنامج تكنولوجيا العصبية موثوقة، من خلال الفضاء والحرب البحرية نظم القيادة (SPAWAR) نظم مركز (SSC) منحة رقم المحيط الهادئ N66001-11-1-4013.
فإن الكتاب أود أن أشكر ميخائيل سليبتشنكو، دون جاهز، جريج ريختر، تايلور هارون، وEliceiri كيفن لتبادل خبراتهم المجهري.
Materials
| Reagents | |||
| Hoechst 33342 | Invitrogen | 14533 | DNA marker |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako (Japan) | 019-19741 | Monocyte antibody |
| Dental acrylic | Lang Dental (various distributors) | Jet Denture Repair Powder & Liquid | Headcap construction |
| Kwik-Sil | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Covering exposed cranial implants |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | Tissue processing |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | Tissue processing |
| Urea | Sigma-Aldrich | U4883 | Clearing solution |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G20225 | Clearing solution |
| Equipment | |||
| Curved micro-scissors | World Precision Instruments | 14208 | Cutting implant before removing brain |
| Razor blades | Ted Pella | (various sizes) | For use with Brain Block |
| Acrylic Brain Matrice | Ted Pella | 15054 | Brain Block to create initial plane in tissue |
| Plastic slides | Ted Pella | 260225 | Mounting tissue |
| Cover glass | Ted Pella | (various sizes) | Mounting tissue |
| Electrode arrays | NeuroNexus Technologies | (various designs) | Example MEAs |
| Vibratome | Leica | VT1000 S | Specific system used in presented method |
| Vibratome blades | (various suppliers) | Collecting slices | |
| 24-well plates | (various suppliers) | Storing and processing tissue slices | |
| Confocal microscope with motorized XY-scanning stage | Carl Zeiss Microscopy | Zeiss LSM 710 and ‘Zen 2010’ software | Specific system used in presented method |
| Soldering iron | (various suppliers) | Excavating headcap |
Referanslar
- Schwartz, A. B. Cortical Neural Prosthetics. Annual Review of Neuroscience. 27, 487-507 (2004).
- Normann, R. A. Technology Insight: future neuroprosthetic therapies for disorders of the nervous system. Nature Clinical Practice Neurology. 3, 444-452 (2007).
- Rousche, P., Normann, R. A. Chronic recording capability of the Utah Intracortical Electrode Array in cat sensory cortex. Journal of Neuroscience Methods. 82, 1-15 (1998).
- Koivuniemi, A., Wilks, S. J., Woolley, A. J., Otto, K. J. Multimodal, longitudinal assessment of intracortical microstimulation. Prog. Brain Res. 194, 131-144 (2011).
- Otto, K. J., Rousche, P. J., Kipke, D. R. Microstimulation in auditory cortex provides a substrate for detailed behaviors. Hearing Research. 210, 112-117 (2005).
- Drake, K., Wise, K., Farraye, J., Anderson, D., BeMent, S. Performance of planar multisite microprobes in recordingextracellular single-unit intracortical activity. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 35, 719-732 (1988).
- Liu, X., et al. Stability of the interface between neural tissue and chronically implanted intracortical microelectrodes. IEEE Trans. Rehab. Eng. 7, 315-326 (1999).
- Williams, J. C., Hippensteel, J. A., Dilgen, J., Shain, W., Kipke, D. R. Complex impedance spectroscopy for monitoring tissue responses to inserted neural implants. J. Neural Eng. 4, 410-423 (2007).
- Polikov, V., Tresco, P., Reichert, W. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 148, 1-18 (2005).
- Szarowski, D. H., et al. Brain responses to micro-machined silicon devices. Brain Research. 983, 23-35 (2003).
- McConnell, G. C., et al. Implanted neural electrodes cause chronic, local inflammation that is correlated with local neurodegeneration. J. Neural Eng. 6, 056003 (2009).
- Holecko, M. M., Williams, J. C., Massia, S. P. Visualization of the intact interface between neural tissue and implanted microelectrode arrays. J. Neural Eng. 2, 97-102 (2005).
- Pierce, A. L., Sommakia, S., Rickus, J. L., Otto, K. J. Thin-film silica sol-gel coatings for neural microelectrodes. J. Neurosci. Methods. 180, 106-110 (2009).
- Wilks, S. Poly(3,4-ethylene dioxythiophene) (PEDOT) as a micro-neural interface material for electrostimulation. Frontiers in Neuroengineering. 2, (2009).
- Johnson, M. D., Otto, K. J., Kipke, D. R. Repeated voltage biasing improves unit recordings by reducing resistive tissue impedances. IEEE Trans Neural Syst. Rehabil. Eng. 13, 160-165 (2005).
- Otto, K. J., Johnson, M. D., Kipke, D. R. Voltage pulses change neural interface properties and improve unit recordings with chronically implanted microelectrodes. IEEE Trans. Biomed. Eng. 53, 333-340 (2006).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14, 1481-1488 (2011).
- Woolley, A. J., Desai, H. A., Steckbeck, M. A., Patel, N. K., Otto, K. J. In situ characterization of the brain-microdevice interface using Device Capture Histology. Journal of Neuroscience Methods. 201, 67-77 (2011).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
- Li, Y., et al. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3, 1703-1708 (2008).
- Clendenon, S. G., Young, P. A., Ferkowicz, M., Phillips, C., Dunn, K. W. Deep Tissue Fluorescent Imaging in Scattering Specimens Using Confocal Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 17, 614-617 (2011).
- Wilks, S. J., Richner, T. J., Brodnick, S. K., Kipke, D. R., Williams, J. C., Otto, K. J. Voltage Biasing, Cyclic Voltammetry, & Electrical Impedance Spectroscopy for Neural Interfaces. J. Vis. Exp. (60), e3566 (2012).
