Özet

Staphylococcus aureus Wachstum mit menschlichen Hämoglobins als Eisenquelle

Published: February 07, 2013
doi:

Özet

Hier beschreiben wir ein Wachstum Assay für<em> Staphylococcus aureus</em> Mit Hämoglobin als die alleinige Quelle der verfügbaren Nährstoff Eisen. Dieser Test stellt die Rolle der bakteriellen Faktoren in Hämoglobin-derived Eisenaufnahme beteiligt.

Abstract

S. aureus ist ein Bakterium, das Eisen durchzuführen lebenswichtige Stoffwechselfunktionen und Krankheiten verursachen erfordert. Das häufigste Reservoir von Eisen im menschlichen Wirt Häm, das der Cofaktor von Hämoglobin ist. Eisen aus Hämoglobin erwerben, S. aureus nutzt ein ausgeklügeltes System, wie der Eisen-regulierten Oberfläche Determinante (Isd) System 1 bekannt. Komponenten des Isd System zuerst bind Host Hämoglobin, dann extrahieren und importieren Häm, und schließlich befreien Eisen aus Häm in dem bakteriellen Zytoplasma 2,3. Dieser Weg ist durch zahlreiche in-vitro-Studien 4-9 wurden seziert. Ferner hat der Beitrag des Isd-System auf eine Infektion immer wieder in Mausmodellen 8,10-14 demonstriert. Gründung der Beitrag des Isd System Hämoglobin-abgeleiteten Eisenaufnahme und das Wachstum hat sich als größere Herausforderung. Growth Assays mit Hämoglobin als einziger Eisenquelle kompliziert by die Instabilität von handelsüblichen Hämoglobin, kontaminierenden freiem Eisen im Nährmedium und Toxizität mit Eisenchelatoren verbunden. Hier präsentieren wir eine Methode, die diese Beschränkungen überwindet. Hochqualitative Hämoglobin wird aus frischem Blut hergestellt und in flüssigem Stickstoff gelagert. Gereinigtes Hämoglobin in ergänzt Eisen-Abbau Mediums imitiert die Eisen-armen Umgebung von Krankheitserregern in der Wirbeltier-Wirt gestoßen. Von hungernden S. aureus von freiem Eisen und Ergänzung mit einer minimal manipulierte Form von Hämoglobin zu induzieren wir Wachstum in einer Weise, die völlig abhängig von der Fähigkeit, Hämoglobin binden, zu extrahieren Häm, Häm passieren durch die bakterielle Zellwand und degradieren Häm im Zytoplasma ist. Dieser Test wird für Forscher, die die Mechanismen der hemoglobin-/heme-derived Eisenaufnahme in S. aufzuklären nützlich aureus und möglicherweise auch andere bakterielle Erreger.

Protocol

Ein. Reinigung von Hämoglobin aus frischem Blut Erwerben frisches menschliches Blut mit einem Antikoagulans ergänzt. Halten Sie Blut auf Eis oder bei 4 ° C während der Reinigung. Zentrifuge Blut für 20 min bei 1.500 x g beträgt. Die roten Blutkörperchen (Erythrozyten) wird am Boden der Röhre liegen. Vorsichtig den Überstand aspirieren und sanft das Pellet in eiskaltem 0,9% (w / v) NaCl-Lösung. Wiederholen Sie die Zentrifugation und 3 x waschen. Das Pellet in 1 Volumen eiskaltem 1…

Representative Results

Wir haben gereinigtes humanes Hämoglobin aus Hämolysat mit HPLC (Protocol Schritt 1,7). Abbildung 1 zeigt aufgezeichnete Absorption des Eluats bei 280 und 410 nm Wellenlänge. Fraktion 5 wurde gesammelt und anderen Fraktionen wurden verworfen. Ausbeuten von fünf bis fünfzehn Milligramm Hämoglobin pro Milliliter des Eluats werden typischerweise erworben. Gereinigtes Hämoglobin wurde durch SDS-PAGE analysiert und in doppelter Ausführung wurden die Gele entweder für Proteine ​​gefärbt oder auf…

Discussion

Eisen ist ein wichtiger Nährstoff, die durch Organismen aus allen Reichen des Lebens 15 erforderlich. Bei Wirbeltieren wird Eisen sequestriert, um die Toxizität von diesem Element zu vermeiden. Diese Sequestrierung birgt auch Eisen aus eindringende Mikroben in einem Prozess als Nahrungsergänzungsmittel Immunität 16 bekannt. In Reaktion darauf haben die Erreger Strategien, Ernährung Immunität zu umgehen entwickelt. Ein solcher Mechanismus beruht auf Hämoglobin, das ist der häufigste Quelle v…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der US Public Health Service Zuschüsse AI69233 und AI073843 aus dem National Institute of Allergy and Infectious Diseases unterstützt. EPS ist ein Burroughs Wellcome Fellow in der Pathogenese von Infektionskrankheiten. KPH wurde von der Cellular and Molecular Microbiology Training Grant Program 5 T32 A107611-10 finanziert.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalogue Number Yorumlar
HPLC anion exchange column Varian PL1551-3802
Drabkin’s reagent Sigma D5941-6VL
Hemoglobin standard Pointe Scientific H7506-STD
RPMI HyClone SH30011.02
Chelex 100 sodium form Sigma C7901
EDDHA LGC Standards GmbH ANC 001
Hemoglobin a antibody Santa Cruz Biotechnology, Inc SC-21005
Tryptic soy agar BD 236920

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Bu Makaleden Alıntı Yapın
Pishchany, G., Haley, K. P., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source. J. Vis. Exp. (72), e50072, doi:10.3791/50072 (2013).

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