Протокол для живых изображений GFP-меченных белков или аутофлуоресцентной структур в отдельных<em> Drosophila</em> Ооцитов описано.
Ооцита дрозофилы была создана как универсальная система для исследования фундаментальных вопросов, таких как функция цитоскелета, клеточной организации, и органелл структуры и функции. Наличие различных GFP-меченных белков означает, что многие клеточные процессы можно наблюдать в живых клетках в течение нескольких минут или часов, и с помощью этой методики, процессы, такие как RNP транспорта, эпителиальный морфогенез, и ткань реконструкции были описаны в мельчайших подробностях в 1,2 Drosophila ооцитов.
Способность выполнять видео изображения в сочетании с богатым репертуаром мутантов позволяет огромное разнообразие генов и процессов, которые будут рассмотрены в невероятных деталях. Одним из таких примеров является процесс ooplasmic поток, который инициирует в середине оогенеза 3,4. Это энергичные движения цитоплазматических пузырьках является микротрубочек и кинезин зависит от 5 и предоставляет полезную системытемпература для исследования функции цитоскелета на этих стадиях.
Здесь я представляю протокол промежуток времени изображение жизни ооцитов, используя практически любые конфокальной микроскопии установки.
Drosophila ооциты являются универсальными модель системы для решения различных вопросов, связанных с функцией и организации клеток и субклеточных компонентов. Полное понимание функции белка требует мониторинга как пространственные, так и временные аспекты поведения белков. Достижения в обеих системах визуализации и генетических инструментов, доступных для Drosophilists сделать его возможным даже для небольших лабораторий для выполнения высоким качеством изображения экспериментов в живой ооцитов. Здесь я изложить протокол анализа поведения GFP с метками или аутофлуоресцентной белков и сооружений в середине-конце оогенеза, который может быть использован в сочетании с различным генетическим фоном для исследования функции белка.
В этом протоколе я опишу процесс, посредством которого ооциты готовы для работы с изображениями и основные конфокальной параметров, которые позволят приобретение промежуток времени видео флуоресцентных белков и сооружений. Дополнительная DetaiЛ. С. О подготовке яйцеклетки описываются Вейль и др. 6. широкий спектр лету штаммов экспрессии белков, которые были эндогенно отмеченных через экзон-захвата доступны 8, и бесконечно больше вариантов белка может быть спроектирован и вновь, чтобы мухи.
При работе с живой тканью, здоровье образцов имеет первостепенное значение. Яйцо камер со сцены 10B может завершить оогенеза в основном автономно 11, что делает их идеальными для краткосрочных исследованиях изображениями. Необходимо соблюдать осторожность на нескольких ключевых шагов, чтобы получить данные высокого качества. Во время рассечения важно, чтобы манипулировать яичников и ооциты как можно меньше, и свести к минимуму количество времени между вскрытие и завершения обработки изображений. В идеале, небольшая станция вскрытие должно быть расположено в том же помещении, где находится конфокальной области, и только несколько камер яйца в то время, должны быть отображены. Число рекомендуется здесь (5-8) Гарантирует, что рассечение время сведены к минимуму при максимальной вероятность получения хорошего качества изображения. Я рекомендую захватить небольшую серию фотографий для оценки качества изображения и убедиться, что захват настройки оптимизированы, прежде чем захватить больше последовательности промежуток времени. Большая часть программного обеспечения позволяет отдельным кадрам, чтобы спастись, и эти изображения могут быть проанализированы различные способы использования ImageJ 12 или другого программного обеспечения.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантом GM096076 из программы ОБЛАСТЬ NIH.
Name | Company | Catalog number | Yorumlar |
Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
#5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
Silicon grease | Sigma Aldrich | Z273554-1EA | |
Glass-bottom Petri dishes | MatTek | P35G-0-20-C |