Live-Imaging von GFP-markierten Proteine ​​in<em> Drosophila</em> Oozyten

Ein. Vorbereiten Flies für Dissection Anesthetize gesunde Fliegen des gewünschten Genotyps (zum Beispiel Ausdruck einer GFP-markierten Protein), die weniger als eine Woche alt sind. Wählen 10-15 große Weibchen mit abgerundeten cremefarbenen Bauch. Übertragen Sie die ausgewählten Fliegen und ein paar (3-5) Männchen in ein Fläschchen mit neuen leicht enthefte Essen und ermöglichen die Fliegen für zwei Tage bei 25 ° C zu mästen Siehe Weil et al. 6 für Details von Drosophila Vorbereitung. Mast die Fliegen sicher, dass eine Vielzahl von Stufen, speziell Stufen 8-12, wird für Bildgebung. Schlecht gemästet oder unfattened fliegt enthalten in der Regel nur sehr frühen Stadien (1-6) und reife (Stufe 14) Oozyten. 2. Vorbereitung der Oozyten for Imaging Mit einem Upright Compound Microscope Bereiten Sie eine Standard-Objektträger aus Glas mit der Anbringung zwei Deckgläschen auf den Objektträger, ca. 1 cm Abstand, mit Silikon greasE. Verwenden Sie nur wenig Fett, um eine gute Abdichtung zwischen dem Deckglas und Rutsche zu gewährleisten. Drücken Sie fest auf jede dem Deckglas wird das Fett dünn und gleichmäßig verteilt. Fügen Sie einige Halocarbonöl 27 (Sigma) an der Verbindungsstelle zwischen den Deckgläsern und Rutsche. Sie werden als Abstandshalter dienen, um zu verhindern verletzt isolierte Eizellen in den nachfolgenden Schritten. Nr. 1,5 Deckgläser funktionieren gut, mit einer durchschnittlichen Dicke (0,16-0,18 mm), die der späten Phase Eizellen übereinstimmt. Platz 2-3 Tropfen Halocarbonöl 27 auf der Oberfläche eines Deckglases 22 mm 2. Um die gesündesten Eizellen zu erhalten, wird eine einzelne Frau aus der Lebensmittel-Fläschchen mit Pipettieren mit dem Mund entfernt und vorsichtig hinterlegt in der Halocarbonöl ohne vorher betäubende. Mit scharfen Pinzette (wie Dumont # 5), Pin die Fliege gegen die Deckglas und ziehen Sie die Spitze des Bauches. Entfernen der Eierstöcke, indem sie entlang der Oberfläche des Deckglases unter dem Öl. Dies fördert adhesion der Oozyten dem Deckglas. Gently necken neben der Eierstöcke, auf der Suche nach Eizellen, die mindestens Stufe 10B des Oogenese sind. Oozyten in dieser Phase kann durch die Suche nach Ei Kammern in dem die Oocyte einnimmt mindestens 50-60% des Gesamtvolumens des Eikammer identifiziert werden. An diesem Punkt in Oogenese haben die Follikelzellen, die über der Oozyte geworden säulenförmig, und umgeben die Oozyte allseitig mit Ausnahme eines kleinen Bereichs, wo Verbindungen mit den Nährzellen bleiben. Verwenden Sie die Pinzette einzelnen Oozyten aus dem Ovariole Mantel zu entfernen. Fortzufahren, mit 1-3 Weibchen, bis 5-8 unbeschädigten Oozyten auf dem Deckglas isoliert worden sind. Entfernen Sie alle unbrauchbar Gewebe. Vorsichtig invertiert das Deckglas mit den Eizellen auf die vorbereiteten so ein, dass die Eizellen zwischen den beiden Abstandshaltern positioniert sind. Drücken Sie nicht auf den invertierten Deckglas, das die Eizellen beschädigen. Falls erforderlich, fügen Sie eine kleine Menge von Halocarbonöl ter Kanten des "Sandwich", um den Raum zu gewährleisten gefüllt ist. (Optional:. Lassen slide rest für ein paar Minuten, um zur Beilegung des Deckglases zu ermöglichen) Der Schlitten ist nun bereit für die Bildgebung. 3. Vorbereitung der Oozyten for Imaging Mit einem Inverted Compound Microscope Eizellen werden seziert im Wesentlichen wie in Abschnitt 2 beschrieben, außer dass kleine Petrischalen mit Glasboden Einsatz (MatTek, 35 mm) werden anstelle der Deckgläser verwendet. Es ist nicht notwendig, die Probe zu bedecken, und nach der Sektion, Gewebe können direkt in den Gerichten abgebildet werden, sondern muss darauf geachtet werden, um sicherzustellen, werden die Eizellen bleiben bedeckt mit Öl und dürfen nicht austrocknen. 4. Live-Imaging Bringen Sie eine Eizelle in den Fokus unter Verwendung von DIC oder Phasenkontrast-Optik und untersuchen die Eizelle auf Anzeichen von Schäden, wie Austreten von Zytoplasma oder Vorwölbung der Follikelzellen. Nur Bild Eizellen, die gesund und unbeschädigt erscheinen. Streaming kann direkt ohne die Notwendigkeit für GFP-Markierungen überwacht werden, da Dotter Vesikel im Zytoplasma autofluoreszierenden 7 sind. Dieses Signal kann im Bereich von FITC Rahmen erfasst werden aber wahrscheinlich erfordern höhere Verstärkungseinstellungen als die für GFP-markierten Proteinen verwendet. Die besten Bilder der Streaming werden aus optischen Schnitte, die knapp unterhalb der Oberfläche der Oocyte, die gegen das Deckglas / Petri Glas aufliegt sind erhalten. Hier die Eizelle ist leicht abgeflacht, so dass für eine bessere Fokusebene. Bilder können bei 200X erfasst werden – 1.000 X. Mit der hier beschriebenen Anordnung, sollte die Luft Ziele verwendet werden, da das Deckglas bildet eine Barriere zwischen der Eizelle und objektiv. Dies ist optimal, weil es stark minimiert Drift und Bewegung der Probe. Sobald ein Bereich von Interesse ist im Fokus, schalten Sie die brighfield Optik und wechseln konfokale Bildgebung. Mit der schnellen Scan / Vorschau-Funktion der Software, stellen Sie konzentrieren und gewinnenwie nötig. Einstellungen für die Aufnahme wird von Mikroskop zu Mikroskop variieren, aber die allgemeinen Parameter sind wie folgt: Verwenden Sie eine Anregungswellenlänge von ~ 488 nm und einer Emissionswellenlänge von ~ 515 nm. Einrichten Z-Achse erfasst, so dass die Z-Achse konstant bleibt, mit einer Verzögerung von 10 Sekunden zwischen den Frames. Erfassen einer Testsequenz von 5-10 Frames um sicherzustellen der Oozyt stationär ist und der Fokusebene angemessen ist. Eine typische Zeitspanne Sequenz zwischen 20 einzufangen – 50 Frames und kann sofort nach Fertigstellung, um die Videoqualität zu beurteilen überprüft werden. Das Verfahren kann für andere Zellen im Schieber wiederholt werden, oder zusätzliche Weibchen können wie erforderlich zerlegt werden. 5. Fehlersuche und häufig auftretende Probleme Drift – Bei Verwendung eines aufrechten Mikroskop, Zellen können manchmal aufgrund der Verbreitung von Öl treiben. Dies kann durch Verwendung nur soviel Öl, um den Bereich unter dem Deckglas abzudecken minimiert werden. Sollten die Probleme fortbestehen, weniger Silikon-gRease anzubringen Abstandshalter auf die Folie. Hinweis: Einige konfokalen Softwarepakete ermöglichen cell tracking, aber im Allgemeinen ist es besser, Bildgebung treiben Eizellen verzichten und stattdessen ein anderes Exemplar. Keine Anzeichen von Streaming – Wenn Streaming ist nicht ersichtlich, ist es wahrscheinlich auf eine von zwei Ursachen: entweder die Brennebene für die Bilderfassung nicht korrekt ist (in der Regel zu tief in das Innere der Oozyte) oder der Eizelle ist beschädigt. Zeit und Praxis minimieren können sowohl Fehler.