A preparação de fatias cerebrais agudas de isolado hipocampo, assim como as gravações simultâneas electrofisiológicas de astrócitos e neurónios em<em> Stratum radiatum</em> Durante a estimulação de schaffer colaterais é descrito. O isolamento farmacológica de potássio astroglial e as correntes do transportador de glutamato é demonstrada.
Os astrócitos formam sinapses com os neurónios tripartidas, onde integrar e modular a atividade neuronal. Na verdade, os astrócitos sentir entradas neuronais através da ativação de seus canais iônicos e receptores de neurotransmissores, e informações do processo, em parte, através da atividade dependente de liberação de gliotransmitters. Além disso, os astrócitos constituem o sistema de captação de glutamato principal, contribuir para o buffer espacial de potássio, bem como a folga do GABA. Estas células, portanto, monitorar constantemente a atividade sináptica, e, assim, são indicadores sensíveis para alterações no glutamato sinapticamente-lançado, o GABA ea extracelular níveis de potássio. Além disso, alterações na atividade captação astroglial ou capacidade tampão pode ter efeitos graves sobre as funções neuronais, e pode ser negligenciada quando caracterizando situações fisiopatológicas ou camundongos knockout. Gravação dupla de atividades neuronais e astroglial é, portanto, um importante método para estudar alterações nasináptica associada à concomitante alterações da captação astrocitária e capacidade de buffer. Aqui descrevemos como preparar fatias de hipocampo, como identificar astrócitos estrato radiatum, e como gravar simultaneamente neuronais e astroglial respostas eletrofisiológicas. Além disso, descreve-se como isolar farmacologicamente as correntes evocadas sinapticamente-astrogliais.
Gravação dupla de sinapticamente induzidas respostas neuronais e gliais é um método útil para estudar alterações on-line em atividades pré e pós-sináptica associada a alterações nas propriedades astrogliais. A despolarização da membrana sinapticamente evocadas glial é uma medida direta do aumento extracelular de potássio 8, em parte devido ao disparo do potencial de ação pré-sináptico, mas principalmente para a despolarização pós-sináptica 7. Por conseguinte, as gravações de dinâmica de potenciais de membrana glial pode ser usado para investigar modificações pré-sináptico da excitabilidade pós-sináptica, a actividade, o volume do espaço extracelular e as capacidades de tamponamento de potássio 6, 8. A corrente transportador astroglial glutamato é uma medida sensível da liberação de glutamato pré-sináptica, capaz de monitorar mudanças de curto prazo na probabilidade de liberação 3, 5, 9. Ele pode, também, ser utilizados para caracterizar as sinapses funcionais da glia interações nas sinapses diferentes, ou em desenvolvimento st diferentemaiores de 10 anos. Deve-se ressaltar que MLDs são altamente sensíveis e temperatura 11 são movidos pelo gradiente eletroquímico de Na +, K + e H 12. Assim, a amplitude e a cinética da corrente GLT altamente dependente das condições experimentais escolhidas. Além disso, o curso de tempo real de folga astroglial glutamato derivado da corrente GLT gravado é conhecido por ser parcialmente obscurecida. Isto deve-se à filtragem de correntes GLT por factores tais como as propriedades de astrócitos electrotonic ou a libertação do transmissor assíncrono, que distorcem a sua cinética 13. Métodos de extracção das características temporais dos mecanismos de filtragem foram desenvolvidos e podem ser utilizados para derivar o tempo real do glutamato curso folga em situações fisiológicas ou patológicas, como recenly realizada 6,13,14. Além disso, a gravação simultânea da despolarização da membrana astroglial, na pinça de corrente, pode proporcionar INSIGhts em possíveis alterações de potássio extracelulares transientes. Astrócitos único contato até 100.000 sinapses dos neurônios diferentes ~ 100, e não, portanto, integrar e modular a atividade de redes locais neuronais.
Ao utilizar a técnica aqui apresentados, ou seja, a gravação eletrofisiológicas de células inteiras respostas de astrócitos para obter insights sobre a atividade sináptica basal, deve-se ter em mente que em astrócitos, patch-clamp gravações no nível soma permitir correntes de detecção principalmente proveniente da soma de células ou processos proximais. Na verdade, correntes detectadas na soma apenas parcialmente originam de multa processos distais quando uma forte ativação de receptores e canais que ocorrem em vários processos finas podem gerar correntes propagando a soma celular. Assim receptor basal e atividade de canal em pequenos processos individuais astrogliais cobrindo compartimentos sinápticas é dificilmente detectável. Isto é devido em parte ao limitado sementes nos coletorescontrole ial e temporal das correntes e tensões de membrana por células inteiras patch-clamp gravações de astrócitos in situ. No entanto, deve notar-se que a superfície das abundantes pequenos processos astrocíticos excede de longe a área da membrana dos processos de soma e principal. Além disso, estes microdomínios perisynaptic astrogliais contêm os receptores funcionalmente relevantes e os canais, o que provavelmente desempenham um papel importante na regulação da comunicação neuroglial e sináptica. A técnica que aqui apresentada é, por conseguinte, principalmente útil para estudar a actividade de integração astrocítica síncrono de conjuntos neuronais, que ocorrem em particular durante a estimulação aferência. Não deve ser usado para estudar o diálogo entre sinapses individuais e adjacentes finos processos astrocíticos que ocorrem durante a actividade espontânea basal. Um método alternativo para estudar as respostas locais astrogliais induzidas pela actividade sináptica basal seria realizar patch-clamp gravações de processos finos, como dum em dendrites 15. Embora remendar esses processos finas gliais é provável desafio devido ao seu pequeno tamanho, é provavelmente uma avenida para buscar a desvendar diálogo mais íntimo entre microdomínios gliais e sinapses individuais. No entanto, os prováveis pequenas eletrofisiológicos respostas gliais decorrentes de processos individuais finas gliais pode estar abaixo de detecção de limiar, já que o ruído elétrico atinge em média 3-5 pA em patch-clamp gravações. Outro método para estudar as respostas astrogliais a actividade sináptica é imagiologia de cálcio, uma vez que a activação de receptores de membrana astrocíticos ou transportadores de substâncias neuroactivas pode desencadear transientes de cálcio intracelular. No entanto, carregamento a granel de astrócitos com indicadores de cálcio também pode refletem principalmente somática atividade 16. A combinação de imagens de eletrofisiologia e cálcio também permite detectar sinais de cálcio a partir de pequenas finas processos gliais, ou ocorrendo espontaneamente ou desencadeada by mínimo de estimulação sináptica 17, 18. No entanto, deve-se ter em mente que os indicadores de alta afinidade de cálcio pode agir como amortecedores de cálcio, inibição das vias importantes de sinalização de cálcio, enquanto que de baixa afinidade indicadores pode funcionar abaixo do nível de detecção. Finalmente, uma técnica elegante e não-invasivo para estudar os eventos de cálcio em processos astrocíticos finas, o que também evita a lavagem de moléculas sinalizadoras intracelulares de células inteiras durante patch-clamp, consiste na utilização de uma membrana sensor de cálcio alvo, que pode ser expresso em astrócitos in situ, bem como in vivo 19. No entanto, a imagem de cálcio só pode fornecer informações sobre uma molécula de sinalização, que está envolvida em muitas, mas não todas as actividades celulares, ao passo que células inteiras de patch-clamp fornece informação quantitativa sobre todas as diferentes correntes iónicas provocadas sobre o canal e activação do receptor. Portanto simultâneas registros eletrofisiológicos de neurônios e astrócitossão um método único e poderoso para desvendar a dinâmica da linha de sinalização iônica neuroglial e seu papel de processamento de informação do cérebro.
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de agradecer a Dana Kamalidenova, Morgan Autexier, e Roch Chopier, que fez o vídeo e animações, bem como Florian Beck para as fotografias e os de pós-produção do vídeo, voz-over. Este trabalho foi patrocinado pela Olympus e suportado por concessões do HFSPO (Prêmio de Desenvolvimento de Carreira), ANR (Programa Jeunes Chercheurs e do Programa de Neurociências Blanc), CRF (Federação pour la Recherche sur le Cerveau), INSERM e Pitié Salpêtrière La hospital (Investigação translacional contrato) para NR, de Francês de Investigação do Ministério e bolsas de pós-doutorado Deutsche Forschungsgemeinschaft à UP, e das escolas de doutoramento "Fronteiras da Ciência da Vida", da Universidade Paris Diderot, Bettencourt Schuller fundação, e FRM comunhão (Fondation pour la Recherche Médicale) doutorado para JS
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Picrotoxin | Sigma | P1675 | dissolve in DMSO |
Kynurenic Acid | Tocris | 0223 | dissolve at 34 °C stirring or sonication |
DL-TBOA | Tocris | 1223 | DCG IV Tocris 0975 |