Due registrazioni elettrofisiologiche di sinapticamente-evocati Risposte astrogliale e neuronale in acute fettine di ippocampo

1. Preparazione del liquido cerebrospinale artificiale e soluzione intracellulare Prima di iniziare l'esperimento, si deve preparare la soluzione interna per registrazioni clamp la patch, così come il fluido cerebrospinale artificiale (ACSF) per la preparazione ippocampo. Avrete inoltre bisogno di un kit composto da dissezione forbice chirurgica e fine forbice iris, due spatole e pinze (strumenti per le scienze Arti), un dispositivo di emissione di gas di vetro (micro-filtro candela, ROBU Germania) e griglia di tessuto (zanzariera o nylon stretto), così come colla (Dent Uhu). La configurazione del setup cerotto fetta elettrofisiologia è stato descritto da Finkel & Bookman, 2001 1. Per la soluzione interna, sciogliere (in mM): 105 K-gluconato, KCl 30, 10 HEPES e EGTA 0,3 in acqua deionizzata (nel 70-80% del volume finale). Raffreddare la soluzione a 4 ° C e aggiungere (in mM): 4 Mg-ATP, GTP-Tris 0,3 e 10 fosfocreatina. Regolare il pH a 7,4 con KOH e riempimento up con acqua deionizzata per il volume finale. (Osmolaritiy: ~ 280 mOsm). Filtrare la soluzione (dimensione dei pori 0,2 micron). Aliquotati soluzione è stabile per 3-4 settimane a – 20 ° C. Per un giorno sperimentale, ~ 1 ml di soluzione interna è necessaria. Se non diversamente indicato, il ACSF usato per la preparazione ippocampo e registrazioni di cellule nella regione CA1, contenente (in mM): 119 NaCl, 2.5 KCl, CaCl 2 2,5, 1,3 MgSO 4, 1 NaH 2 PO 4, 26,2 NaHCO 3 e 11 glucosio. Sciogliere questi sali in acqua deionizzata (Osmolarità ~ 320 mOsm) e ossigenare la soluzione per almeno 10 minuti (pH ~ 7,3-7,4) con CarboGen (95% O 2 e il 5% di CO 2). Preparare almeno 1 litro di soluzione per esperimento. Particolare cura deve essere presa per la preparazione di tessuto dell'ippocampo che verrà utilizzato per eseguire esperimenti nella regione CA3 dell'ippocampo. Infatti, questa regione è soggetta a epilettiformi attività e successiva morte neuronale. Così SYNAPTattività IC deve essere fortemente ridotta durante la preparazione fetta, e questo si ottiene eseguendo la dissezione dell'ippocampo in ghiacciata soluzione di saccarosio contenente (in mM): NaCl 87, 2,5 KCl, CaCl 2 0,5, 7 MgCl 2, 1 NaH 2 PO 4 , 25 NaHCO 3, 10 e 75 Saccarosio Glucosio. In questa soluzione, la combinazione di sodio bassa, bassi livelli di calcio e magnesio concentrazioni elevate massicciamente ridurre cottura presinaptica e probabilità di distacco, nonché postsinaptica attività del recettore NMDA, minimizzando attività spontanea e la morte cellulare. Una volta preparata, fettine ippocampali utilizzati per registrazioni di cellule della regione CA3 vengono perfuse con ACSF modificato, contenente 4 mM CaCl 2 e 4 MgSO 4, per ridurre al minimo l'attività polisinaptici. 2. Acuta Preparazione Slice ippocampale Raffreddare ~ 300 ml di ACSF per la camera di taglio, così come per la preparazione a 4 ° C, mentre costantemente ossigenante conCarboGen. Preparare un piccolo becher con ACSF a temperatura ambiente (RT) per la memorizzazione slice, che è anche ossigenato con carbogeno (Schema Figura 1). Anestetizzare il mouse sotto una cappa con un tovagliolo di carta imbevuto piccola con 1 ml di isoflurano che viene aggiunto nella gabbia. Dopo che il mouse è profondamente anestetizzato, tagliare la testa e inserirlo direttamente in un piccolo piatto con ghiacciata ACSF ossigenato. Rimuovere il cuoio capelluto con una piccola forbice e trasferire la testa sul tessuto per le fasi successive. Iniziare a sezionare l'ippocampo, come illustrato e descritto in Figura 1. Tagliare 300-400 micron fette trasversali a bassa velocità (3 micron / sec) e la frequenza di vibrazione di 70 Hz a freddo ghiaccio ossigenato ACSF, e trasferirli in una camera di stoccaggio. Lasciare riposare le fette a temperatura ambiente per almeno 1 ora prima della registrazione. Fette per CA3 esperimenti sono memorizzati 25 min a 34 ° C e almeno 30 min a RT, per recuperare dal processo di taglio. </ol> 3. Doppia registrazione di Evocati Correnti astrogliale e potenziali di campo neuronali Noi qui viene descritto come registrare sinapticamente-evocato risposte astrogliali e neuronale, vale a dire le risposte indotte dalla attivazione delle sinapsi attraverso la stimolazione afferenza utilizzando un elettrodo extracellulare. Costantemente perfondere camera di registrazione con ACSF ossigenato (1,5-2 ml / min, RT), contenente 100 mM picrotossina (GABA A antagonista) per isolare risposte eccitatorie. Trasferire una fetta su un poli-L-lisina (1,5 a 3 mg / ml) coprioggetto rivestiti, immergere il liquido per ottenere una buona adesione fetta e aggiungere una goccia di ASCF sopra della fetta. Posizionare il vetrino nella camera di registrazione. Il blocco della trasmissione inibitoria da picrotossina può provocare attività epilettiforme, cioè spontaneo, cottura sincrona di popolazioni neuronali, che distorcono la misurazione degli eventi evocati. Così, per impedire attività epilettiforme, effettuare unataglio piatto (solo la superficie) tra le regioni CA1 e CA3 per impedire la propagazione attraverso il collaterali Schaffer (come indicato in Figura 2a). Stratum radiatum astrociti possono essere identificati dalla loro dimensione soma piccolo (circa 10 micron) e processo di assemblaggio stellate. Scegli una cella almeno 20-30 micron sotto la superficie fetta. Montare un elettrodo di stimolazione di vetro (resistenza tip ~ 1 MW) sul filo d'argento che è collegato alla scatola isolamento stimolo e messa a terra per il bagno (semplicemente avvolgendo il secondo filo argento intorno pipetta di vetro). Posizionare l'elettrodo di stimolazione nella regione collaterale Schaffer, come indicato in Figura 2A a una distanza di 200-300 micron di distanza dal astrociti scelto. Montare l'elettrodo di registrazione di campo (~ 2-5 MW) su un filo di argento clorurato collegato al headstage dell'amplificatore. Entrambi gli elettrodi sono riempiti prima con ACSF. Scegliere in modo Multiclamp I = 0, che disabilita com esternocomando di input e posizionare l'elettrodo ~ 50 pm dal astrociti nella regione stratum radiatum (Figura 2A). Registrare le risposte con Gain 2 a 10 e filtro con un filtro di Bessel 2 kHz. Iniezione di corrente elettrica nel cervello innesca fetta potenziali d'azione nei dintorni assoni collaterali Schaffer e il rilascio del trasmettitore successivo ai terminali presinaptici che postsinaptici progetto di neuroni piramidali CA1. I trasmettitori rilasciati attiverà un flusso di carica positiva nelle cellule attraverso i recettori post-sinaptici ionotropici, che è misurabile extracellulare come un potenziale piccolo negativo. Questo campo potenziale postsinaptico eccitatorio (fEPSP) integra l'attività di un gruppo di neuroni attivi contemporaneamente, mentre la trasmissione inibitorio è bloccato farmacologicamente. Applicare alcuni impulsi di test (0.1 msec durata) per evocare un fEPSP, alcuni riposizionamento degli elettrodi di stimolazione potrebbe aiutare ad aumentare la fEPSP. Un tipico CA1 strato Radiatum fEPSP è illustrato nella figura 2B. Ulteriori dettagli sul posizionamento e la risposta forme d'onda possono essere trovati in Yuan et al. 2003 2. L'ampiezza fEPSP in una fetta sana dell'ippocampo di solito dovrebbe essere più di due volte più grande come l'ampiezza del volley fibra. Per la quantificazione accurata di ampiezza fEPSP o pendenza, il reponse evocato deve essere monosinaptico, come attività polisinaptici (rilevabile come un multi-picco di risposta) indica l'attività sinaptica indipendente dalla stimolazione elettrica, che potrebbe essere un segno per ipereccitabilità. Per gli esperimenti effettuati nella regione CA3 dell'ippocampo, stimolazione e pipette di registrazione sono posizionati come illustrato in Figura 3C. Per identificare in modo chiaro gli ingressi in fibra di muschio, che sono fortemente accoppiati, facilitando impulsi di stimolazione (50 msec dell'impulso intervallo) e 1 Hz stimolazione per alcuni secondi vengono applicati per migliorare in maniera massiccia l'ampiezza inizialmente basso evocato fEPSP responses.At finedell'esperimento, DCGIV, un recettore mGluR2 / 3 antagonista, può essere lavato per verificare ulteriormente che gli ingressi fibre muschiose effettivamente stati stimolati. L'applicazione di questo antagonista dovrebbe ridurre il fEPSP da ~ 90% a causa della alta espressione di mGluR2 / 3 recettori inibendo rilascio presinaptico da boutons fibre muschiose. Riempire una pipetta patch (~ 2-5 MW) con filtrato soluzione interna e montarlo su un filo di argento clorurato collegato al secondo headstage, applicare una pressione positiva con una siringa, che è collegato mediante un tubo al portapipette. Costantemente applicare un impulso di prova 20 msec di 10 mV e spostare la pipetta nel tessuto fino a raggiungere la superficie cellulare e le deformazioni della membrana diventa visibile. Azzerare la pipetta offset, togliere la pressione positiva, e bloccare la membrana – mV 80. Attendere fino a quando un gigaseal (almeno 1 GΩ) viene raggiunto (non dovrebbe richiedere più di alcuni secondi). Applicazione delicata di qualche pressione negativa potrebbe aiutare a raggiungere agigaseal. Penetrare nella cellula viene raggiunto da una breve applicazione di pressione negativa o utilizzando la funzione zap in Multiclamp. Avviare la registrazione simultanea delle garanzie Schaffer evocato fEPSP e la risposta astrogliale in voltage-clamp (Vhold – 80 mV; frequenza di 0,1 Hz guadagno, filtro di Bessel 2 kHz, 10). La risposta astrogliale attuale è bifasica: in primo luogo si vedrà una veloce corrente transitoria verso l'esterno, che riflette fEPSPs generati dalle adiacenti cellule piramidali. Questo è seguito da un lento aumento e decadente verso l'interno (secondi alcuni persistenti (> 10 sec) dopo il termine delle risposte neuronali) attuali. Questa corrente è dovuto principalmente all'entrata potassio in astrociti, seguito dal rilascio circostante depolarizzate terminali postsinaptici. Un attivati ​​contemporaneamente veloce trasportatore del glutammato transitorio di corrente (GLT), innescato da rilascio di glutammato presinaptico è mascherato dalla corrente di potassio. Il potenziale di mantenimento della astrociti, così come la resistenza accesso del cerotto deve essere monitored tutto l'esperimento e non deve variare di oltre il ~ 20%, al fine di evitare il controllo impreciso di reponses astrogliali a causa di variazioni delle condizioni di registrazione. Astrociti Solo con una potenzialità iniziale di partecipazione> -70 mV devono essere indagati per studiare le cellule sane. Passare dalla tensione e corrente-clamp, al fine di registrare la depolarizzazione della membrana evocato astrociti. Isolare il trasportatore del glutammato gliale (GLT) corrente perfusione dell'acido ionotropici bloccante del recettore glutammato chinurenico (5 mM), finché il fEPSP è completamente bloccato e l'ampiezza GLT ha raggiunto un plateau. Per identificare con chiarezza l'attuale GLT, applicare l'antagonista specifico DL-treo-β-Benzyloxyaspartatic acido (DL-TBOA, 200 pM). Aumentare la forza stimolazione da due volte a 5 volte per registrare le risposte neuronali e astrogliale a diversa forza sinaptica, e applicare due stimoli ravvicinati intervallo (50 msec) per indagare le risposte alla stimolazione impulsi accoppiati. Stabilità della serie rpotenziale esistance e la membrana della cellula gliale devono essere monitorate per la registrazione. Per visualizzare l'entità del gap-junction mediata reti astrogliali, colorante esperimenti di accoppiamento deve essere eseguito in modalità current clamp, senza alcuna corrente di iniezione, per consentire la diffusione passiva di coloranti molecolari bassi (<1,5 kDa), come solforodamina-B, attraverso i canali di giunzione gap. Per minimizzare spillover colorante nel tessuto circostante, pressione positiva deve essere applicato tramite pipetta patch basta quando entrano nel tessuto e la patch dovrebbe essere raggiunto il più presto possibile.