Dual-Elektrophysiologische Recordings synaptisch-evozierte astrogliale und neuronale Antworten in Acute Hippocampusschnitte

Ein. Herstellung künstlicher Liquor und intrazelluläre Lösung Vor dem Start des Experiments ist es nötig, die interne Lösung für die Patch-Clamp-Aufnahmen sowie die künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) für den Hippocampus präparieren. Sie werden darüber hinaus brauchen eine Dissektion Kit bestehend aus chirurgischen Schere und feine Iris Schere, zwei Spatel und Pinzette (Fine Science Tools), ein Glas Begasungseinrichtung (Mikro-Filterkerze ROBU Deutschland) und Gewebe Grid (Moskitonetz oder Nylon fest), sowie Sekundenkleber (Uhu Dent). Die Konfiguration der Patch-Setup Elektrophysiologie Scheibe wurde durch Finkel & Bookman, 2001 1 beschrieben. Für die interne Lösung, aufzulösen (in mM): 105 K-gluconat, 30 KCl, 10 HEPES und 0,3 EGTA in entionisiertem Wasser (in 70-80% des Endvolumens). Man kühlt die Lösung auf 4 ° C und addiert (in mM): 4 ATP-Mg, 0,3 GTP-Tris und 10 Phosphokreatin. Der pH-Wert auf 7,4 mit KOH und fill up mit deionisiertem Wasser auf das Endvolumen. (Osmolaritiy: ~ 280 mOsm). Filter für diese Lösung (Porengröße 0,2 &mgr; m). Aliquotierte Lösung ist stabil für 3-4 Wochen bei – 20 ° C. Für ein experimentelles Tag, ~ 1 ml der internen Lösung benötigt. Sofern nicht anders angegeben, enthält das für ACSF Hippocampus Herstellung und Aufnahmen von Zellen in der CA1-Region verwendet wird, (in mM): 119 NaCl, 2.5 KCl, 2.5 CaCl2, 1.3 MgSO4, 1 NaH 2 PO 4, 26,2 NaHCO 3 und 11 Glucose. Lösen Sie diese Salze in destilliertem Wasser (Osmolarität ~ 320 mOsm) und Sauerstoff dieser Lösung für mindestens 10 min (pH ~ 7,3 – 7,4) mit Carbogen (95% O 2 und 5% CO 2). Planen mindestens 1 Liter Lösung pro Versuch. Besondere Sorgfalt ist bei der Zubereitung von hippocampalen Gewebe, verwendet werden, um Experimente in der CA3 Region des Hippocampus durchführen wird, zu berücksichtigen. Tatsächlich ist diese Region anfällig für Aktivität und anschließende Neuronentod epileptiforme. So SYNAPTic Aktivität sollte stark während slice Vorbereitung reduziert werden, und dies wird erreicht, indem die Hippocampus Dissektion in eiskaltem Saccharose-Lösung enthält (in mM): 87 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl 2, 7 MgCl 2, 1 NaH 2 PO 4 , 25 NaHCO 3, 10 Glucose und 75 Sucrose. Bei dieser Lösung ist die Kombination von niedrigem Natriumgehalt, niedrige Kalzium und hohen Magnesium-Konzentrationen massiv reduzieren präsynaptischen Brenn-und Freisetzungs-Wahrscheinlichkeit sowie postsynaptischen NMDA-Rezeptor-Aktivität, und minimiert so spontane Aktivität und Zelltod. Einmal hergestellt, hippocampalen Schnitten für Aufnahmen von Zellen aus der CA3 Region verwendet werden mit modifiziertem ACSF perfundiert, enthaltend 4 mM CaCl 2 und 4 MgSO4, um polysynaptischen zu minimieren. 2. Akute Hippocampusschnitt Vorbereitung Cool down ~ 300 ml ACSF zum Aufschneiden Kammer, als auch für die Vorbereitung bei 4 ° C, während er ständig sauerstoffartig mitCarbogen. Vorbereiten eines kleinen Becherglas mit ACSF bei Raumtemperatur (RT) für Slice Speicherung, die auch mit Carbogen (Schema 1) wird mit Sauerstoff angereichert. Anesthetize die Maus unter einer Haube mit einem kleinen Papiertuch mit 1 ml Isofluran, die in den Käfig gegeben wird eingeweicht. Nachdem die Maus ist tief narkotisiert, schneiden Sie den Kopf ab und fügen Sie ihn direkt in eine kleine Schüssel mit eiskaltem oxygenierten ACSF. Entfernen Sie die Kopfhaut mit einer kleinen Schere und überweisen Sie den Kopf auf das Gewebe für die nachfolgenden Schritte. Start, um den Hippocampus zu sezieren, wie dargestellt und beschrieben in Abbildung 1. Cut 300-400 um dicke Transversalschichten bei niedriger Drehzahl (3 um / sec) und Vibration Frequenz von 70 Hz in eiskaltem Sauerstoff ACSF, und übertragen Sie sie in eine Vorratskammer. Lassen Sie die Scheiben Rest bei RT für mindestens 1 Stunde vor der Aufnahme. Slices für CA3 Experimente werden 25 min bei 34 ° C gelagert und mindestens 30 min bei RT, um aus dem Aufschneidebereich Prozess wiederherzustellen. </ol> 3. Dual Recording evozierter astrogliale Currents und neuronale Feldpotentiale Wir beschreiben hier, wie die Aufnahme astrogliale und neuronalen Reaktionen, dh Reaktionen von synapse Aktivierung durch Afferenz Stimulation mit einer extrazellulären Elektrode induziert synaptisch-evozierte. Ständig versorgen die Aufnahme Kammer mit sauerstoffreichem ACSF (1.5-2 ml / min, RT), mit 100 uM Picrotoxin (GABA A-Antagonist) auf exzitatorische Antworten zu isolieren. Übertragen einer Scheibe auf eine Poly-L-Lysin (1,5 bis 3 mg / ml) beschichteten Deckglas, genießen die Flüssigkeit ein gutes Stück Haftung zu erzielen und einen Tropfen ASCF auf der Scheibe. Legen Sie das Deckglas in die Aufnahme Kammer. Blockade der inhibitorischen Übertragung durch Picrotoxin können in epileptiforme Aktivität führen, dh spontan, synchrone Feuern von neuronalen Populationen, die die Messung evozierter Ereignisse verfälscht wird. So zum epileptiforme Aktivität zu vermeiden, stellen einflachen Einschnitt (nur die Oberfläche) zwischen den CA1 und CA3 Regionen zur Verhinderung der Ausbreitung über die Schaffer-Kollateralen (wie in 2a gezeigt). Stratum radiatum Astrozyten können durch ihre geringe soma Größe (~ 10 &mgr; m) und sternförmige Prozess der Montage identifiziert werden. Wählen Sie eine Zelle mindestens 20-30 um unterhalb der Scheibenoberfläche. Montieren Sie ein Glas Stimulationselektrode (Kippstabilität ~ 1 M) auf dem Silberdraht, die auf den Reiz Isolation Box verbunden und geerdet, um das Bad (einfach durch Umwickeln des zweiten Silberdraht um die Glaspipette). Platzieren Sie die Stimulationselektrode in die Schaffer Sicherheiten Region, wie in 2A in einem Abstand von 200-300 um weg von der gewählten Astrozyten gekennzeichnet. Montieren Sie die field recording Elektrode (~ 2-5 MOhm) auf einem chlorierten Silberdraht mit dem Headstage des Verstärkers. Beide Elektroden befinden sich vorher mit ACSF gefüllt. Wählen Sie in MultiClamp den Modus I = 0, die externe com deaktiviertBefehls-Eingang und die Elektrode ~ 50 um weg von der Astrozyten in das Stratum radiatum Bereich (2A). Notieren Sie die Antworten mit Gain 2 bis 10 und Filter mit einem 2 kHz Bessel-Filter. Elektrische Strominjektion in die Hirnschnittkultur auslöst Aktionspotentiale in den umliegenden Schaffer Sicherheiten Axonen und anschließende Transmitterausschüttung an den präsynaptischen Enden dieses Projekt an postsynaptische CA1 pyramidalen Neuronen. Die freigesetzten Transmitter löst eine positive Ladung fließen in die Zellen durch postsynaptische ionotropen Rezeptoren, die messbar ist extrazellulär als ein kleines negatives Potential. Dieses Feld exzitatorischen postsynaptischen Potentials (fEPSP) integriert die Aktivität einer Gruppe von gleichzeitig aktiven Neuronen, während hemmende Übertragung pharmakologisch blockiert ist. Gelten einige Testimpulse (0,1 ms Dauer), um eine fEPSP erinnern, einige Neupositionierung der Stimulationselektrode könnte helfen, die fEPSP erhöhen. Ein typisches CA1 Stratum Radiatum fEPSP ist in 2B dargestellt. Weitere Einzelheiten zur Positionierung und Antwort Wellenformen können in Yuan et al. 2003 2. Die fEPSP Amplitude in einem gesunden Hippocampusschnitt sollte in der Regel mehr als doppelt so groß wie die Amplitude der Faser volley. Für eine genaue Quantifizierung der fEPSP Amplitude oder Neigung sollte der evozierten reponse sein monosynaptischen als polysynaptischen Aktivität (detektierbaren als Multi-Spitzenempfindlichkeit) zeigt synaptischen Aktivität unabhängig von der elektrischen Stimulation, die ein Zeichen für Übererregbarkeit sein könnten. Für Experimente in der CA3 Region des Hippocampus durchgeführt werden Stimulation und Ableitung Pipetten positioniert, wie in 3C veranschaulicht. Zur eindeutigen Identifizierung Moosfaser Eingänge, die dringend erleichtert werden, gepaarte-Puls Stimulation (50 Zwischenpulsintervall msec) und 1 Hz Stimulation für einige Sekunden aufgebracht massiv verbessern die anfänglich niedriger Amplitude hervorgerufen fEPSP responses.At das Endeder Versuch DCGIV ein mGluR2 / 3 Rezeptor-Antagonist kann in weiter sicherzustellen, dass tatsächlich Moosfaser Eingänge stimuliert wurden gewaschen werden. Anwendung dieses Antagonisten sollten die fEPSP von ~ 90% aufgrund der hohen Expression von mGluR2 / 3 Rezeptoren hemmen präsynaptischen Freisetzung aus Moosfaser boutons reduzieren. Füllen eines Patch-Pipette (~ 2-5 MOhm) mit gefilterter interne Lösung und montieren es auf einem chlorierten Silberdraht mit dem zweiten Headstage gelten Überdruck mit einer Spritze, die über eine Rohrleitung in einen Pipettenhalter verbunden ist. Ständig gilt ein 20 ms Testimpuls von 10 mV und bewegen Sie die Pipette in das Gewebe bis zur Zelloberfläche und erreichen eine Auslenkung der Membran sichtbar. Null der Pipette Offset, entfernen Sie den Überdruck, und klemmen Sie die Membran auf – 80 mV. Warten Sie, bis eine undurchlässige (mindestens 1 G) erreicht ist (es sollte nicht länger dauern als ein paar Sekunden). Sanfte Anwendung einiger negativer Druck könnte helfen, ag erreichenigaseal. Brechen Sie in die Zelle wird durch einen kurzen Anwendung von Unterdruck erreicht oder mit dem zap Funktion Muffe. Starten Sie die gleichzeitige Aufzeichnung der Schaffer Sicherheiten evozierte fEPSP und die astrogliale Antwort in Spannungsklemme (Vhold – 80 mV, Frequenzbereich 0,1 Hz, Bessel-Filter 2 kHz, Verstärkung 10). Die astrogliale aktuelle Antwort ist biphasisch: Zuerst wird eine schnelle transiente Auswärtsstrom zu sehen, was fEPSPs durch benachbarte Pyramidenzellen generiert. Dies wird durch einen langsam ansteigenden und abfallenden Einwärtsstrom (mehrere Sekunden andauernde (> 10 sec) nach Beendigung des neuronalen Antworten) gefolgt. Dieser Strom ist vor allem Kalium Einstieg in Astrozyten, nach der Entlassung von umliegenden depolarisiert postsynaptischen Terminals. Ein gleichzeitig aktiviert schnelle transiente Glutamat-Transporter Strom (GLT), gefolgt von präsynaptischen Freisetzung von Glutamat ausgelöst wird durch die kaliumsparende aktuellen maskiert. Die Haltepotential der Astrozyten, sowie der Zugang Widerstand der Patch sollte sein monitored während des Experiments und sollte nicht um mehr als ca. 20%, zu ungenauen Überwachung astroglialen reponses aufgrund von Veränderungen in den Aufnahmebedingungen vermeiden. Nur Astrozyten mit einer anfänglichen Beteiligung Potenzial> -70 mV sollte untersucht werden, um gesunde Zellen zu studieren. Umschalten von Spannungs-Strom-Clamp um die evozierte astrozytären Membrandepolarisierung aufzuzeichnen. Isolieren der glialen Glutamat-Transporter (GLT) Strom durch Perfusion des ionotropen Glutamat-Rezeptor-Blocker Kynurensäure (5 mM), bis die fEPSP vollständig blockiert ist und die Amplitude GLT ein Plateau erreicht. Zur eindeutigen Identifizierung der GLT Strom, gelten die spezifischen Antagonisten DL-threo-β-Benzyloxyaspartatic Säure (DL-TBOA, 200 uM). Steigern der Stimulation igen 2-fach bis 5-fach bis neuronalen und astroglialen Reaktionen bei unterschiedlichen synaptischen Stärke aufzunehmen, und wenden zwei eng beabstandeten Stimuli (50 msec Intervall), um Antworten auf gepaarten Impulses Stimulation untersucht. Stabilität der Serie resistance und Membranpotential des Gliazelle sollte während der Aufzeichnung überwacht werden. Zur Visualisierung der Umfang des Gap-Junction vermittelt astroglialen Netzwerken sollte Farbstoff-Kupplung Experimente in Stromklemme Modus durchgeführt werden, ohne Strominjektion auf passive Diffusion niedermolekularer Farbstoffe (<1,5 kDa), wie Sulforhodamin-B zu ermöglichen, durch Gap Junction Kanälen. Farbstoffzubereitungen Übergreifen in das umgebende Gewebe zu minimieren, sollte Überdruck durch die Patch-Pipette aufgetragen werden nur bei der Eingabe des Gewebes und das Pflaster sollte so rasch wie möglich erreicht werden.