编制急性脑切片中分离出海马,以及同步的星形胶质细胞和神经元的电生理记录<em>地层radiatum</em刺激Schaffer侧支时。隔离的星形胶质细胞的钾和谷氨酸转运体电流的药理证明。
星形胶质细胞与神经元的三方突触形成合力,在那里他们整合和调节神经元的活动。事实上,星形胶质细胞感测通过其的离子通道和神经递质受体激活的神经元的输入,并通过活性依赖性释放gliotransmitters部分的过程信息。此外,星形胶质细胞谷氨酸构成的主吸收系统,有助于钾空间缓冲以及GABA的间隙。因此,这些细胞不断监测突触活动,从而改变突触释放的谷氨酸,GABA和细胞外钾水平的敏感指标。此外,星形胶质细胞摄取活性的改变或缓冲能力产生严重影响神经功能,特性时,可能会忽略病理生理情况或基因敲除小鼠。双记录的神经元和星形胶质细胞的活动,因此是一个重要的方法来研究改变相关的伴随突触强度的变化,星形胶质细胞的吸收和缓冲能力。在这里,我们将介绍如何准备海马脑片,如何识别地层radiatum星形胶质细胞,并同时记录神经元和星形胶质细胞的电生理反应。此外,我们将介绍如何药理突触诱发的星形胶质细胞电流隔离。
双记录的突触诱导的神经元和神经胶质细胞的反应是一个非常有用的方法,,网上学习改建前和突触后活动相关的星形胶质细胞特性的变化。突触诱发的神经胶质膜的去极化是一种直接测量细胞外钾离子的上升,部分由于突触前动作电位射击,但主要是突触后去极化7。因此录音的胶质膜电位的动态可以使用调查修改的兴奋性突触,突触后活动,细胞外空间的容积和钾的缓冲能力6,8。星形胶质细胞谷氨酸转运体电流的突触前谷氨酸的释放,能够监测短期变化,释放概率3,5,9是一个敏感的措施。在不同的突触或在不同发育第一,它可进一步被用来表征的功能性突触神经胶质细胞的相互作用10岁。应该强调的是GLTs温度敏感性高的11和被驱动的Na +,K +和H 12的电化学梯度。因此,振幅和动力学的GLT当前的高度依赖于所选择的实验条件。此外,星形胶质细胞的谷氨酸间隙过程中来自记录的GLT电流的实际的时间是已知的部分变模糊。这是由于过滤GLT电流的因素,如电张性能的星形胶质细胞,或异步递质释放,歪曲其动力学13。方法提取的过滤机制的时间的功能已被开发,并可以使用,以获得实际的谷氨酸间隙时间过程在生理或病理情况下,作为recenly执行6,13,14。此外,在电流钳,同时记录的星形胶质细胞的细胞膜去极化,可以提供INSIG高温超导可能改变细胞外钾瞬变。单星形胶质细胞联系起来,以10〜100种不同的神经元突触,因此整合和调整本地的神经元网络活动。
当使用这里介绍的技术, 即记录电全细胞的反应从星形胶质细胞为基础的突触活动中获得的见解,一个人应该记住,在星形胶质细胞,膜片钳记录在SOMA水平允许检测电流主要源于胞体或近端的过程。事实上,胞体检测到的电流只有部分源于精细的远端过程时激活的受体和渠道发生在多道精细的工序,可以产生强大的电流,传播到胞体。因此,基础受体和渠道活动覆盖突触车厢的个人的小星形胶质细胞过程是很难检测到。这是部分原因是由于有限的卵的胶质和时间控制膜电流和电压的全细胞膜片钳记录,从星形胶质细胞原位 。然而,应该注意的是,表面的大量微小的星形细胞进程超过迄今为止胞体和主要过程的膜面积。此外,这些perisynaptic的星形胶质细胞的微区包含功能相关的受体和渠道,这可能在的神经胶质通信和突触的调控中发挥了重要的作用。因此,我们这里介绍的是该技术主要用于研究神经元集合的同步活动,特别是在发生afference刺激的星形胶质细胞融合。它不应该被用于研究个人星形胶质细胞突触和相邻的精细过程发生在基础的自发活动之间的对话。研究当地的基础突触活动的星形胶质细胞反应的另一种方法是执行膜片钳记录道精细的工序,为d树突15。虽然修补这些精美的星形胶质细胞的过程可能具有挑战性,由于其体积小,它可能是一个途径,追求解开星形胶质细胞的微区之间更亲密的对话和个体突触。然而,可能小电星形胶质细胞反应产生的个人精美的星形胶质细胞的过程可能会低于阈值检测,电气噪声达到平均3-5 pA的膜片钳记录。研究星形胶质细胞的突触活动的另一种方法是钙成像,因为激活的星形胶质细胞的细胞膜受体或转运神经活性物质可以引起细胞内钙瞬变。然而,批量加载的星形胶质细胞钙指标主要反映躯体活动16。结合电生理和钙成像,也可以检测的小钙信号从细小的星形胶质细胞的过程,无论是自然发生的或触发bŸ最小的突触刺激17,18。然而,人们应该牢记,高亲和力的的钙指标可能像钙的缓冲区,抑制重要的钙信号转导通路,而低亲和力的指标可能低于检测水平。最后,一个优雅的和非侵入性技术研究钙事件,精致的星形胶质细胞的过程,这也规避冲刷的细胞内信号分子,在全细胞膜片钳,包括使用膜有针对性的钙传感器,它可以在星形胶质细胞中表达在原位 ,以及在体内 19。然而,钙成像只能提供一个信号分子,参与了许多,但并不是所有的细胞活动有关的信息,而全细胞膜片钳提供所有不同的离子电流通道和受体激活后引发的定量信息。因此同时从神经元和星形胶质细胞的电生理记录是一个独特而强大的在线神经胶质细胞离子的信号,它的作用大脑信息处理的动态方法解开。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢达纳Kamalidenova,摩根Autexier,和罗克Chopier,谁做的视频和动画,以及弗洛里安·贝克的照片和后期制作的视频语音。这项工作是由奥林巴斯赞助和支持职业发展奖(HFSPO),ANR(规划署,青年chercheurs和神经科学计划相思),FRC(联邦争取RECHERCHE SUR LE Cerveau),INSERM和LaPitiéSalpêtrière医院(转化研究的补助金合同)NR,从法国研究部和德意志研究联合会博士后奖学金,并从学校的博士“生命科学中的前沿”,巴黎狄德罗大学,贝当古·舒勒基金会,FRM(基金会争取RECHERCHEMédicale)博士生奖学金到JS
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Picrotoxin | Sigma | P1675 | dissolve in DMSO |
Kynurenic Acid | Tocris | 0223 | dissolve at 34 °C stirring or sonication |
DL-TBOA | Tocris | 1223 | DCG IV Tocris 0975 |