肝動脈再建を用いた部分同所性肝移植のラットモデルのための外科的処置

1。基本的なテクニックと共通の手順すべての手順は、クリーンしかし非無菌条件下で行われる。 ラットの腹部がオープンされたら、すべての手続きは、16倍の倍率で手術用顕微鏡下で行われる。胆管と肝動脈へのステントの挿入、および肝動脈の再建、肝臓下の下大静脈：例外は10xで行われるex vivoでの肝切除、および25倍で行われ、次の手順であり、 （IHVC）、胆管。 綿棒は、臓器、組織の鈍的切開、および圧縮止血の穏やかな操作に使用されます。乳酸加リンゲル液を浸したガーゼ綿棒（5×5センチ）は肝臓や腸を後退させるために、臓器の潤いを保つために使用されます。 Satinskyクランプは左またはIHVC周り手術野を広げるために、ラットの尾部に向かってガーゼで覆われた腸の収縮のために使用することができます。 すべてのライゲーションは、4から0絹糸が使用されてex vivoでの肝切除時の肝葉の茎を除いて、6から0絹糸で実行されます。リガチャーは、第二字が最初に1までの距離で行うことができ、かつ2点間のライゲーション分裂が適切に行うことができるようにライゲーションされたポイントに十分な張力を提供するDeBakeyブルドッグクランプまたは他の楽器でプルアップすることができます。 すべての静脈内注射は、陰茎静脈を介して実行されます。 肝上の下大静脈（SHVC）、門脈、肝動脈、胆管、オイルベースの​​粘土の小さな塊のための再建手続き中に末梢血管クランプやモスキート鉗子の指輪を保持するために使用されの位置にそれらを固定した状態に保ちます。 2。術前準備 230と250グラムの間で体重の雄Lewisラット肝移植のドナーとレシピエントとして使用されています。ラットはすべてです麻酔導入まで水や食品への無料アクセスを借りていた。 門脈（図1）カフ：顕微鏡下で11番メス刃で14ゲージのカテーテルを切断することによって、門脈のためにカフを準備します。カフは、本体と拡張、2mmの長さを持つ各で構成されています。スレッドが滑り落ちることなく、袖口にしっかりと固定することができるように、蚊の鉗子で円周方向にステップバイステップカフの壁をクランプしてカフ上の円周の溝を作る。 胆管と肝動脈（図1）ステント：肝動脈と胆管に5mmのために4ミリメートルの長さのカテーテルの両端にベベルを生成するために顕微鏡下でメスでカット24番ゲージのカテーテル。 3。ドナー操作ドナーラットから肝臓の除去のスキーマを図2に示します。この手順では、約必要imately 30から35分。 メンテナンスのため、2L /分で麻酔導入のための4 L / minの流速で100％酸素、1.5体積％でイソフルレン4体積％の吸入によりラットを麻酔。鎮痛剤として皮下ブプレノルフィン（0.1 mg / kg）を注入します。加熱パッド上にラットを入れ、磁気固定器退避システム（図3a）を使用して、アッパーアームを固定します。ラットの全腹部領域から毛皮を剃ると、ポビドンヨード溶液による対応する皮膚を殺菌。 二国間の拡張子を持つ正中切開により腹部を開きます。 SHVCが腹上昇しているように、ラットの背部の下で5mlの注射器を置きます。モスキート鉗子を使用して、クランプと頭に向かって剣状突起を引き、手術野（図3a）を開くために肋骨下トラクタを適用します。 鎌状靱帯と左三角靱帯を切開。次に、左横隔膜静脈を結紮し、分割します。 レトリぬれたガーゼ綿棒で上向きの中央値と左横ローブを振る舞う。バイポーラピンセットを用いて、左横と前尾状葉の間にパラ食道の血管を凝固させると分割します。 ラットの左側に腹部外腸を移動して、濡れたガーゼ綿棒でそれらをカバーしています。ぬれたガーゼ綿棒で上向きの右側葉を収納してください。後腹膜組織からIHVCを隔離し、ちょうど移植片を除去する前に後で分割され、右副腎静脈を結紮する。 胆管（図3b）にステントを挿入するには： 胃十二指腸動脈の分岐レベルで胆管を結紮する。胆管周囲の軟部組織をできるだけ温存すべきであり、肝動脈から総胆管の分離は、胆管に十分な動脈血供給を確保することは避けるべきである。 ストレートマイクロハサミで、anteriに小さな切開を加えるまたはライゲーション点に近接した胆管の壁。左手でストレートマイクロピンセットで切開の前壁を押さえながら、右手に曲がったマイクロ鉗子を用いてダクト内にステントを挿入し、6から0絹糸で固定します。スレッドが後で吻合中に開催することができるように、カットのいずれかが胆管上のスレッドの端部は4mmの長さに保たれる。 結紮し、それらを分割することによって幽門および脾静脈から門脈を解放する。 胃十二指腸動脈を結紮し、分割し、そのルートに膵頭部から肝動脈（CHA）を分離。綿棒で右に肝臓を回転させたり、肝臓や食道の背面の周囲靭帯を切開。 肝切除のための準備が完了した時点で、リトラクター、剣状突起のために蚊鉗子、ラットの背中の下に5 mlのシリンジを取り外します。 abdominaに腸を戻すlの空洞。 陰茎静脈を介して生理食塩水2mlにヘパリンナトリウムの500 IUを注入します。約3分後、5 mlの注射器、蚊鉗子、とリトラクターをリセットします。そのルートに近位CHAをライゲーションする。カットの一つはCHA長い間結紮糸の端部が保管してください。 モスキート鉗子で右腎静脈にIHVC近くにクランプした後、脾静脈の切り株下使い捨てマイクロ血管クランプで門脈をクランプします。門脈の前壁を切開し、門脈に18ゲージのカテーテルを挿入します。 20センチメートルH 2 Oの静水圧で冷ヒスチジン-トリプトファン-ケトグルタル酸（HTK）溶液60mlで、その場で肝臓を灌流その直後に、横隔膜をカットし、胸腔内下大静脈を横断すると、灌流液が肝臓（図3c）で洗い流されるのを許容するのIHVCの前壁を切り開いた。 DIとIHVCクランプsposableマイクロ容器はちょうど肝臓の下にクランプします。わずかに肝臓と右腎静脈、脾静脈の切り株下門脈、横隔膜、肝臓の奥に残っている靭帯、右副腎静脈の間の中間点以下IHVCを解剖によって切除する肝​​臓をとそのルートにCHA。砕いた氷のフルプラスチックの箱に取り付けられた金属製のカップに冷たいHTK液に摘出肝臓を置きます。 4 エクスビボ移植片準備肝移植のためのすべての手順は、氷のように冷たいHTKの溶液を充填金属カップで実行されます。 ex vivoでの移植の準備は約30分必要です。 門脈（図4）カフの取り付けのための： DeBakeyブルドッグクランプ付き門脈トランクをクランプします。飲みながらブリッジ位置（図4a、b）にクランプを置きます。カフを介して門脈を入れて、クランプ再び一緒に12時の位置（図4c）のカフの拡張子のついた門脈。 7時の位置にカフの外側脾静脈の切り株を配置するためにカフの上門脈の壁を裏返す（図4d）と、6から0絹糸（図4e）と門脈を確保。 肝動脈（図5）にステントを挿入するには： 鉗子によりダイヤフラムの両端をクランプして肝臓を修正し、ストレートDeBakeyブルドッグクランプ（図5a）で結紮糸を保持することによってCHAを引き出します。ストレートマイクロハサミで、CHAの前壁に小切開を加える。左手で、ストレートマイクロピンセットで切開の前壁を保持し、右手で、湾曲したマイクロ鉗子を使用して、CHAにステントを挿入します。ステントは、以前ヘパリンナトリウム溶液（100 IU / ml）を（図5b-D）で洗浄する。 Secure 6-0絹糸でステント、4 mmの長さで糸の切断端部のいずれかを保持します。冷たいHTK液5mlと動脈カテーテルを通して肝臓をフラッシュします。 50％肝切除（図6）の場合： 代わりに、それを修正する蚊鉗子で後部尾状葉をクランプします。 4から0絹糸（図7a）とその茎を結紮した後に葉を切除。同様にして、前方の尾状葉を削除します。 プラスチックの箱を90度回転させます。ダイアフラムと中葉の左部分の右端をクランプします。中葉の二国間の部分の境界線の上縁に小切開を加えて、[ライゲーション（図7b）の後に左の部分を削除します。 4から0絹糸で茎を結紮した後に左の側葉を取り除きます。バイポーラピンセットで慎重に切除した肝臓表面を焼灼する。その結果、肝臓の質量が減少しますpproximately 50パーセント15（図7c、d）である 。 SHVCの形成術（図8）の場合： モスキート鉗子（図8a）と横隔膜の両方のエッジをクランプすることにより、肝臓の位置を固定する。対応するダイアフラムを除去することによってSHVCの前壁をトリムします。後で吻合（図8b）1滞在縫合糸として両隅に外側から内側へ2 7から0ポリプロピレン縫合糸を取り付けます。その後SHVCの後壁をトリムします。 4で肝臓移植を保管°冷水浴中HTKのソリューションのC。 5。受信者動作レシピエントラットにおける移植片移植のスキーマを図9に示します。受信者の操作が肝外性の時間の10月11日分とIHVCクランプ時間の約23から24分を含む60から70分を必要とします。 場合と同じ手順を実行し二国間の拡張（図10a）なし正中切開により腹部の開口部を除いても操作（3.1〜3.4）。 IHVC周り手術野を得るために、十二指腸および腸全体の右側の上に濡れたガーゼの綿棒を置きます。左横隔膜下腔に左横および中央値ローブを入れ、濡れたガーゼ綿棒で上向きの右側葉を撤回。後腹膜組織からIHVCを分離します。結紮すると右副腎静脈（図10b）を分割します。ぬれたガーゼや綿棒を使用すると、左側に肝臓を回転させたり、肝臓の背面の周囲靭帯を切開。 解剖学的位置に右の側葉を返します。上向きの中央値と左横ローブをカバーし、後退させるためにぬれたガーゼの綿棒を置きます。ちょうど尾状葉から枝下胆管を横断する。胆管周囲の軟部組織をできるだけ温存する必要があります。目の切り口の一つに保つ長さ4 mmの時、胆管結紮用をお読みください。 胃十二指腸動脈とCHAから分岐〜3 mmの距離で固有肝動脈を結紮し、分割します。その後、CHAの終わりに動脈のY構造を作る。長い4 mmで固有肝動脈結紮のためのスレッドの切断端部のいずれかを保持します。綿棒で右に肝臓を回転させると、左側から肝臓の背面の周囲靭帯を切開。 乳酸リンゲル溶液2 mlを静脈注射した後に、ちょうど右腎静脈上記金属マイクロ血管クランプでIHVCをクランプします。ラットの左側から蚊鉗子による肝門部での分岐のレベルで門脈をクランプします。末梢血管クランプによる右側から横隔膜と一緒SHVCをクランプし、オイルベースの​​粘土の塊でクランプの指輪を修正。 肝外性の時に0.4体積％イソフルランで麻酔を削減（デュレーション門脈のクロスクランプ）。消費税​​SHVC、門脈、と次のレベルでIHVC解剖で受取人ネイティブ肝臓：SHVC、SHVCと肝臓の間の国境で、ちょうど蚊鉗子の顎の上に、門脈と、前記わずかに肝臓と右腎静脈（図10c）の中間点以下IHVC、。同所性肝移植を置きます。 連続縫合（図11）によってSHVCの吻合について： 血管壁を把持または縫合針を保持するための縫合処置の間に左手に曲がったマイクロ鉗子を使用しています。まず、結び目を（またはすべての縫合の手順が完了した後にそれを結ぶことができます）に結合することにより、続いてグラフトの右上隅に添付された7から0ポリプロピレンを使用することによって、内部から外部への受信者SHVCに滞在縫合糸を配置します。次に、左側のトウモロコシで、同じ方法で、2つ目の滞在縫合糸を配置ランニングステッチ縫合の開始になりますえー、。吻合を広げるには、把握しsuperiolaterally優しい牽引（図11a、b）の両隅にDeBakeyブルドッグクランプを使用して縫合糸を維持します。 ピアース密接に結び目外部へ外部から内部への移植側の壁を貫通して左の隅に縫合し、右下隅（図11c）に7から8ステッチで腔内SHVCの事後行を縫合。慎重に内部の管腔が互いに直面している最初の数ステッチを作る。外部への移植側の血管を通る右コーナーでは、ピアス7-0ポリプロピレン。 次に、約10針（図11d）と、右から左へ、外から前の行を縫合。前列の完了前に、気泡を除去するために乳酸リンゲル液で内部を洗浄してください。できるだけ近く前の行に最後のステッチを作る滞在左隅に縫合し、それらを結びつけることが可能に。 カフ技術（図12）による門脈再建のために： ぬれたガーゼ綿棒で上向きの中央値と左横のローブを収納してください。右から使い捨てマイクロ血管クランプを使用して幽門静脈との合流点に、受信者の脈をクランプします。粘土でクランプが門脈そのモスキート鉗子を修正し、肝門部（図12a、b）は向かって鉗子の先端を引き出します。 ちょうど蚊鉗子の顎下門脈の前壁を切開する。レシピエントの門脈と乳酸リンゲル液によるカフの内側を洗います。左手と右手に曲がったマイクロピンセットでカフの拡張子でストレートマイクロピンセットで切開の前壁を保持します。深くレシピエントの門脈にカフを挿入し、ネジで固定し円周6から0絹糸（図12c-F）。 門脈とSHVCのクランプを解放した後、肝臓をreperfuse。ラットの背部から5mlのシリンジを取り外し、0.8体積％イソフルランの濃度を増加させる。 ステント技術16（図13）による肝動脈再建のために： まず、左側から蚊鉗子によって受取人固有肝動脈のスレッドを保持し、肝門部に向かってそれを引っ張って、[閉じる膵臓（図13a）に右側からの受取人CHAをクランプします。 ストレートマイクロ鉗子で、漏斗状の開口部を作るために受信者CHAの末尾にY字構造の分岐点に小さな切開を加える。湾曲したマイクロピンセットで移植CHAに置かステントを保持します。ヘパリンナトリウム溶液（100 IU / ml）で各内腔を洗浄した後、再にステントをスライドcipient CHAと6から0絹糸で固定します。ので、両方一緒にCHASは吻合部（図13b）の減少テンションでお互いに近づくことを受信者CHAのこのスレッドとグラフトCHA上の4 mmの糸の一端を接続します。その後、クランプを解放します。 連続縫合（図14）によってIHVCの吻合について： SHVCの場合と同じ方法で吻合するが、細かい咬傷（図14a-d）でもっとステッチを使用しています。最後のステッチで縫合糸の結束を解消することができるか、抱き合わせはきつく結ぶことによって引き起こされる吻合部狭窄を回避するために、成長因子を用いて達成することができます。 declamping後、1.0体積％に麻酔の濃度を増加させる。吻合部狭窄が見える場合は、二国間の滞在縫合糸を引っ張ったり、吻合を拡大して優しく前列を広げることにより吻合部位を拡張する。 8.4パーセント重曹solutioの0.5mlを投与静脈乳酸リンゲル溶液1.0mlを持つn。 出血や胆汁の漏れを防ぐために、切除された肝臓表面を密閉するTachosilの小さな断片を適用します。 ステント技術による胆管の再建のために： 左側から蚊鉗子によって受信者胆管のスレッドを保持します。粘土で蚊鉗子を修正し、肝門部に向かって鉗子の先端を引き出します。 再構築された胆管が長すぎではないように、適切なレベルでの胆管に小切開を加えます。ねじれを避けるために細心の注意を持つ受信者がダクトにグラフト胆管に入れたステントを挿入し、6から0絹糸で固定します。移植ダクトの受信者ダクトと4 mmのスレッドでこのスレッドを一緒に結ぶので、両方のダクトは吻合部の減圧テンションでお互いに近づくこと。 再建手続きが完了した時点で、1メートルを注入5％ブドウ糖溶液のリットル静脈（図15）。 十分な止血を確認した後、2層に連続4から0 VICRYL縫合で腹部切開を閉じます。 6。術後の治療とフォローアップ使用直後、生理食塩水1.5mlの合計でフロキシムナトリウムの皮下注射（16 mg / kg）を使用して受信者のラットを治療し、ブプレノルフィン（0.1 mg / kg）を。ラットは、暖められた空気と特別な集中治療室のケージ（30〜35℃）、酸素供給の60分間に回復することができます。 3日間皮下に鎮痛剤としてブプレノルフィン（0.1 mg / kg）を12時間ごとに注入する。その後、通常のケージにラットを動かし、水と食べ物に不断のアクセスを提供します。