العمليات الجراحية لنموذج الفئران من الجزئي زرع الكبد orthotopic مع إعادة الإعمار الكبدي الشرياني
Özet
زراعة كبد في الفئران هو نموذج تجريبي لا غنى عنه للبحوث الطبية الحيوية. هنا نقدم إجراءاتنا الجراحية لزرع الكبد الفئران مثلي مع إعادة الإعمار كبدي الشرايين باستخدام الكسب غير المشروع 50٪ جزئية.
Abstract
زراعة كبد (OLT) في الفئران باستخدام الكسب غير المشروع كليا أو جزئيا هو نموذج تجريبي لا غنى عنها للبحث زرع، مثل دراسات عن الفساد ونقص التروية الحفاظ-ضخه 1،2 الإصابة، والاستجابات المناعية 3،4، 5،6 ديناميكا الدم، و صغيرة الحجم مقابل متلازمة 7. وOLT الفئران هي من بين النماذج الحيوانية أصعب في الجراحة التجريبية وتتطلب مهارات المجهرية المتقدمة التي تستغرق وقتا طويلا للتعلم. ونتيجة لذلك، اقتصر استخدام هذا النموذج. منذ الموثوقية واستنساخ نتائج هي المكونات الرئيسية لهذه التجارب التي تستخدم فيها مثل هذه النماذج الحيوانية معقدة، فمن الضروري للجراحين الذين يشاركون في الفئران OLT للتخصص في مجال إجراءات جيدا موحدة ومتطورة لهذا النموذج.
في حين تم التقنيات المختلفة وإدخال تعديلات على OLT في الفئران عن 8 منذ النموذج الأول كان describبقلم لي وآخرون. 9 في عام 1973، والقضاء على كبدي الشرايين التعمير (10) وإدخال هذه التقنية من قبل مفاغرة صفعة Kamada وآخرون. هناك 11 تقدما كبيرا في هذا النموذج، لأنها تبسيط إجراءات إعادة البناء إلى حد كبير . في هذا النموذج من قبل Kamada وآخرون، تم القضاء أيضا rearterialization الكبد. منذ الفئران يمكن البقاء على قيد الحياة دون تدفق كبدي الشرايين بعد زرع الكبد، كان هناك جدل كبير حول قيمة arterialization الكبد. ومع ذلك، فقد تم التفوق الفسيولوجية للنموذج arterialized اعترف على نحو متزايد، وخاصة من حيث الحفاظ على النظام والقناة الصفراوية 8،12 سلامة الكبد 8،13،14.
في هذا المقال سنتطرق العمليات الجراحية مفصلة عن نموذج الفئران من OLT مع إعادة الإعمار كبدي الشرايين باستخدام الكسب غير المشروع 50٪ جزئية بعد الكبد السابقين فيفو resecنشوئها. يتم تنفيذ إجراءات التعمير لكل سفينة والقناة الصفراوية بواسطة الطرق التالية: أ خياطة البولي بروبلين 7-0 المستمر لفوق وinfrahepatic الوريد الأجوف؛ تقنية صفعة للالوريد البابي، وتقنية الدعامات للشريان الكبدي و والقناة الصفراوية.
Protocol
1. التقنيات الأساسية والإجراءات المشتركة يتم تنفيذ جميع الإجراءات في ظل ظروف نظيفة ولكن غير المعقمة. مرة واحدة يتم فتح البطن من الفئران، يتم تنفيذ جميع الإجراءات تحت المجهر الجراحي في التكبير 16X من. الاستثناءات هي الكبد فيفو السابقين استئصال، والتي تتم في 10X، والإجراءات التالية، التي يتم تنفيذها في 25X: ادراج دعامة في القناة الصفراوية والشريان الكبدي، وإعادة بناء الشريان الكبدي، والوريد الأجوف infrahepatic (IHVC)، والقناة الصفراوية. وتستخدم قطعة قطن للتلاعب لطيف من الأجهزة، تشريح حادة من الأنسجة، والإرقاء الضغط. وتستخدم مسحات شاش (5 × 5 سم) مع الحل رينغر غارقة أفرز اللبن لسحب الكبد أو الأمعاء، وإبقاء الأجهزة رطبة. يمكن استخدام المشبك Satinsky للتراجع من الشاش المغطاة الأمعاء نحو اليسار أو ذيل الفأر لتوسيع مجال الجراحة في جميع أنحاء IHVC. يتم تنفيذ كافة عمليات ربط بخيط الحرير 6-0 باستثناء العنيقات من فصوص الكبد أثناء استئصال الكبد السابقين فيفو، حيث تستخدم خيوط الحرير 4-0. يمكن سحب ربطة بواسطة المشبك بلدغ ديباكي أو غيرها من الصكوك لتوفير التوتر كافية لدرجة ligated بحيث يمكن جعل ربطة الثاني في مسافة لأول واحد، ويمكن أن يتم تقسيم بين النقطتين ligated بشكل صحيح. يتم تنفيذ جميع الحقن في الوريد عن طريق الوريد القضيب. خلال إجراءات إعادة البناء لفوق الكبد الوريد الأجوف (SHVC)، والوريد البابي، الشريان الكبدي، والقناة الصفراوية، وجود تورم صغير من الطين التي تعتمد على النفط تستخدم لعقد البنصر من المشبك على الأوعية الدموية الطرفية أو ملقط البعوض للحفاظ على إصلاحها في الموقف. 2. إعداد سابق للجراحة وتستخدم الفئران الذكور وزنها بين 230 لويس و 250 غرام والجهة المانحة والمتلقية لزرع الكبد. الفئران كلهاالمستحقة حرية الوصول إلى الماء والغذاء وحتى تحريض التخدير. صفعة للالوريد البابي (الشكل 1): إعداد صفعة للالوريد البابي من خلال خفض قسطرة قياس 14-بشفرة المشرط 11 عدد تحت المجهر. الكفة يتكون من الجسم والتمديد، ولكل منها طول 2 ملم. جعل أخاديد محيطية على صفعة من لقط جدار خطوة بخطوة صفعة محيطي مع ملقط البعوض بحيث يمكن تثبيتها بإحكام على مؤشر ترابط الكفة دون الانزلاق. الدعامات للالقناة الصفراوية والشريان الكبدي (الشكل 1): قص 24-قياس القسطرة مع مشرط تحت المجهر لإنتاج الحافات على طرفي القسطرة والذي يبلغ طوله 4 مم لالشريان الكبدي و5 مم لقناة الصفراء . 3. عملية المانحة يظهر مخطط إزالة الكبد من الفئران المانحة في الشكل 2. هذا الإجراء يتطلب تقريباimately 30-35 دقيقة. تخدير الفئران مع استنشاق isoflurane المجلد 4٪ في الأكسجين بنسبة 100٪ في معدل التدفق من 4 لتر / دقيقة لتحريض التخدير، و 1.5٪ في المجلد 2 L / دقيقة للإنفاق. حقن البوبرينورفين (0.1 مجم / كجم) تحت الجلد بمثابة مسكن. وضع الفئران على وسادة التدفئة، وإصلاح الذراعين باستخدام تراجع التبعي المغناطيسي نظام (الشكل 3A). حلق الفراء من منطقة البطن بأكمله من الفئران، وتعقيم الجلد المقابلة مع حل بوفيدون. فتح البطن من قبل شق خط الوسط مع ملحقات الثنائية. وضع حقنة 5-مل تحت الجزء الخلفي من الفئران بحيث يتم ترفيع SHVC بطنيا. باستخدام ملقط البعوض، وسحب المشبك عملية الخنجري نحو الرأس، وتطبيق الكامشات تحت الضلع لفتح جراحي ميداني (الشكل 3A). تشريح الرباط المنجلي والرباط الثلاثي اليسار. المقبل، وتقسيم ligate الوريد الأيسر الحجابي. RETRالعمل الفص الجانبي الأيسر ومتوسط التصاعدي مع مسحة الشاش الرطب. باستخدام ملقط الثنائي القطب، وتخثر الأوعية تقسيم شبه المريء بين الفص الأيسر الوحشي المذنبة والأمامية. نقل الأمعاء خارج البطن على الجانب الأيسر من الفئران، وتغطيتها مع مسحة الشاش الرطب. سحب الفص الجانبي الحق التصاعدي مع مسحة الشاش الرطب. عزل IHVC من الأنسجة خلف الصفاق، وligate السياق الحق الكظرية، والتي سيتم تقسيمها في وقت لاحق قبل إزالة الكسب غير المشروع. لإدراج الدعامات في القناة الصفراوية (الشكل 3B): Ligate القناة الصفراوية في مستوى المتفرعة من الشريان المعدي الاثناعشري. ينبغي الحفاظ على الأنسجة الرخوة المحيطة القناة الصفراوية إلى أقصى حد ممكن، وينبغي تجنب الفصل بين القناة الصفراوية من الكبد الشريان لتأمين إمدادات كافية الدم الشرياني إلى القناة الصفراوية. مع مقص الدقيقة على التوالي، وجعل شق صغير في anteriأو جدار القناة الصفراوية الأقرب إلى نقطة ligated. في حين الضغط على الجدار الأمامي للشق مع ملقط الصغر على التوالي في اليد اليسرى، اضافة الى وجود دعامات في القناة باستخدام ملقط المنحني الدقيقة في اليد اليمنى، وضمان الحصول عليها مع خيط الحرير 6-0. يتم الاحتفاظ واحدة من قطع ينتهي من الموضوع على القناة الصفراوية بطول 4 مم بحيث يمكن عقد الموضوع خلال مفاغرة في وقت لاحق. تحرير الوريد البابي من الأوردة البواب والطحال من ligating وتقسيمها. Ligate وتقسيم الشريان المعدي الاثناعشري، ثم عزل الشريان الكبدي المشترك (CHA) من رأس البنكرياس لجذورها. تدوير الكبد إلى اليمين مع مسحات القطن، وتشريح الرباط حول الجانب الخلفي من الكبد والمريء. عند الانتهاء من الأعمال التحضيرية لاستئصال الكبد وإزالة الكامشات، وملقط البعوض لعملية الخنجري، والحقنة 5-مل تحت الجزء الخلفي من الفئران. العودة إلى الأمعاء abdominaL تجويف. حقن 500 وحدة دولية من صوديوم الهيبارين-في 2 مل من محلول ملحي طبيعي عن طريق الوريد القضيب. حوالي 3 دقائق في وقت لاحق، إعادة تعيين حقنة 5-مل، وملقط البعوض، والكامشات و. Ligate في CHA الأقرب إلى جذورها. الحفاظ على واحدة من قطع ينتهي من الموضوع ligated لCHA طويلة. بعد انتهاء التثبيت IHVC إلى الوريد الكلوي والحق مع ملقط البعوض، المشبك الوريد البابي مع المشبك السفينة الصغيرة يمكن التخلص منها دون الجذع من الوريد الطحالي. شق الجدار الأمامي للالوريد البابي، وإدراج قسطرة قياس 18-في الوريد البابي. يروي الكبد في الموقع مع 60 مل من محلول الباردة (HTK) الحامض الاميني تريبتوفان-كيتوغلوتارات في الضغط الهيدروليكي من 20 سم 2 O. H مباشرة بعد ذلك، وقطع الحجاب الحاجز والقطع في داخل الصدر الوريد الأجوف، وقطع الجدار الأمامي للIHVC مفتوحة للسماح تشطف الحل نضح من الكبد (الشكل 3C). المشبك IHVC مع ديسفينة صغيرة sposable تضييق أسفل الكبد. استئصال الكبد عن طريق تشريح IHVC أقل قليلا من نقطة الوسط بين الكبد والوريد الكلوي الأيمن، والوريد البابي تحت الجدعة من الوريد الطحالي، والحجاب الحاجز، والأربطة المتبقية في الجزء الخلفي من الكبد، والحق الوريد الكظرية، وCHA من جذورها. وضع الكبد رفعه في حل HTK الباردة في كوب معدني محمولة في علبة بلاستيكية كامل من الثلج المجروش. 4. فيفو السابقين الكسب غير المشروع إعداد يتم تنفيذ كافة إجراءات الكسب غير المشروع الكبد في كأس معدنية مليئة حل HTK الجليد الباردة. الكسب غير المشروع فيفو السابقين إعداد يتطلب ما يقرب من 30 دقيقة. لإلحاق صفعة إلى الوريد البابي (الشكل 4): المشبك الجذع الوريدي بوابة مع المشبك بلدغ ديباكي. وضع المشبك في وضع سد على كأس (الشكل 4A، ب). وضع الوريد البابي من خلال الكفة، والمشبكالوريد البابي مرة أخرى جنبا إلى جنب مع توسيع نطاق صفعة في موضع الساعة 12 (الشكل 4C). إيفرت جدار الوريد البابي على الكفة لوضع الجذع من الوريد الطحالي خارج صفعة في المركز 7 الساعة (الشكل 4D)، وتأمين الوريد البابي مع خيط الحرير 6-0 (4E الشكل) . لإدراج الدعامات في الشريان الكبدي (الشكل 5): إصلاح الكبد عن طريق لقط كل حواف الحجاب الحاجز بواسطة ملقط، وسحب CHA على التوالي من خلال عقد ligated الموضوع مع المشبك بلدغ ديباكي (الشكل 5A). مع مقص الدقيقة على التوالي، وجعل شق صغير في الجدار الأمامي للCHA. مع اليد اليسرى، مع الاستمرار على الجدار الأمامي للشق مع ملقط الصغر على التوالي، ومع اليد اليمنى، اضافة الى وجود دعامات في CHA باستخدام ملقط المنحني الدقيقة. يتم غسل سابقا الدعامات مع الهيبارين صوديوم حل-(100 وحدة دولية / مل) (الشكل 5B-D). Secure الدعامات مع خيط الحرير 6-0، والحفاظ على واحدة من قطع ينتهي من الموضوع بطول 4 مم. مسح الكبد عن طريق القسطرة الشريانية مع 5 مل من محلول HTK الباردة. لاستئصال الكبد 50٪ (الشكل 6): المشبك الفص الخلفي المذنبة مع ملقط البعوض لتصحيح الامر في المكان. يقطع الفص بعد ربط من عنيق مع وخيط الحرير 4-0 (7A الشكل). بنفس الطريقة، قم بإزالة الفص الأمامي المذنبة. تدوير البلاستيك مربع 90 درجة. المشبك الحافة اليمنى من الحجاب الحاجز والجزء الأيسر من الفص المتوسط. إجراء شق صغير في الحافة العلوية من الحدود من أجزاء من الفص الثنائية الوسيط، ثم قم بإزالة الجزء الأيسر بعد ربط (7B الشكل). إزالة الفص الجانبي الأيسر بعد ربط للعنيق مع خيط الحرير 4-0. كوى سطح الكبد مقطوعة بعناية مع ملقط ثنائي القطب. ونتيجة لذلك، يتم تقليل كتلة الكبد من قبلpproximately 50٪ 15 (الشكل 7C، د). لرأب من SHVC (الشكل 8): إصلاح موقف كل من الكبد عن طريق لقط حواف الحجاب الحاجز مع ملقط البعوض (الشكل 8A). تقليم الجدار الأمامي للSHVC عن طريق إزالة الحجاب الحاجز المقابلة. خيوط البولي بروبلين إرفاق اثنين 7-0 من الخارج إلى الداخل في كل زوايا والبقاء الغرز لمفاغرة في وقت لاحق (8B الشكل). ثم تقليم الجدار الخلفي للSHVC. تخزين الكبد الكسب غير المشروع في 4 درجات مئوية في حل HTK في حمام المياه الباردة. 5. المتلقي عملية يظهر مخطط زرع الفساد في الفئران المتلقية في الشكل 9. العملية يتطلب 60-70 دقيقة المتلقي، والذي يتضمن 10-11 دقيقة من الوقت ما يقرب من 23-24 anhepatic ودقيقة من الوقت IHVC لقط. تنفيذ الإجراءات نفسها كما في دوولا عملية (3،1-3،4) باستثناء افتتاح البطن بواسطة شق خط الوسط، بدون ملحقات الثنائية (الشكل 10A). وضع الشاش الرطب مسحة على الجانب الأيمن من الاثني عشر والأمعاء كلها للحصول على جراحي ميداني حول IHVC. وضع فصوص الجانبي الأيسر وسيطة في تجويف تحت الحجاب اليسار، وسحب الفص الجانبي الحق التصاعدي مع مسحة الشاش الرطب. عزل IHVC من الأنسجة خلف الصفاق. Ligate وتقسيم الوريد الحق الكظرية (الشكل 10B). مسحات الشاش مع والقطن مبللة، تدوير الكبد إلى اليسار، وتشريح الرباط حول الجانب الخلفي من الكبد. العودة الفص الجانبي الحق إلى الموضع التشريحي. وضع الشاش الرطب مسحة لتغطية التراجع والفص الجانبي الأيسر ومتوسط أعلى. القطع القناة الصفراوية أقل بقليل من فرع من الفص المذنب. ينبغي الحفاظ على الأنسجة الرخوة المحيطة القناة الصفراوية إلى أقصى حد ممكن. الحفاظ على واحدة من قطع ينتهي من القراءة ligated لفي القناة الصفراوية-4 مم طويلة. Ligate وتقسيم الشريان المعدي الاثناعشري والشريان الكبدي السليم على مسافة 3-مم إلى المتفرعة من CHA. ثم، وجعل Y-هيكل الشريان في نهاية CHA. الحفاظ على واحدة من قطع ينتهي من الموضوع ligated لالشريان الكبدي السليم في-4 مم طويلة. تدوير الكبد إلى اليمين مع مسحات القطن، وتشريح الرباط حول الجانب الخلفي من الكبد من الجانب الأيسر. بعد الحقن في الوريد من 2 مل من محلول رينجر أفرز اللبن، المشبك IHVC مع مشبك معدني سفينة صغيرة فقط فوق الوريد الكلوي الأيسر. المشبك الوريد البابي على مستوى التشعب في نقير الكبد وبواسطة الملقط البعوض من الجانب الأيسر من الفئران. المشبك SHVC مع الحجاب الحاجز من الجانب الأيمن من المشبك على الأوعية الدموية الطرفية، وإصلاح البنصر من المشبك في قطعة من الطين التي تعتمد على النفط. الحد من التخدير مع isoflurane إلى٪ 0،4 خلال المجلد الوقت anhepatic (مدةعبر لقط من الوريد البابي). استئصال الكبد الأصلي المستلم من قبل تشريح SHVC، الوريد البابي، وIHVC على المستويات التالية: في SHVC، على الحدود بين SHVC والكبد، والوريد البابي، وذلك فوق الفك من ملقط البعوض، و وIHVC، أقل قليلا من نقطة الوسط بين الكبد والوريد الكلوي الأيمن (الشكل 10C). وضع الكسب غير المشروع الكبد orthotopically. لمفاغرة من SHVC من قبل خياطة مستمرة (الشكل 11): ملقط المنحني استخدام الدقيقة في اليد اليسرى أثناء إجراء خياطة لاستيعاب جدار الوعاء الدموي أو عقد إبرة خياطة. أولا، ضع خياطة الوقف على SHVC المستفيدة من الداخل إلى الخارج عن طريق استخدام البولي بروبلين المرفقة 7-0 في الزاوية اليمنى للالكسب غير المشروع تليها ربط عقدة (أو يمكنك ادراك التعادل بعد جميع الإجراءات خياطة كاملة). المقبل، ضع خياطة يبقى في المركز الثاني بنفس الطريقة في الذرة اليسارإيه، والتي سوف تكون بداية لغرزة غرزة على التوالي. لتوسيع مفاغرة، والحفاظ على فهم الغرز باستخدام ديباكي المشابك في كل زوايا بلدغ مع الجر لطيف superiolaterally (الشكل 11A، ب). اختراق خياطة في الزاوية اليسرى من خلال الجدار على الجانب الكسب غير المشروع من الخارج إلى الداخل إلى الخارج بشكل وثيق عقدة، وخياطة الصف الخلفي من SHVC intraluminally مع 7 حتي 8 غرز في الزاوية اليمنى (الشكل 11C). جعل غرز القليلة الأولى بعناية بحيث تواجه وشمعة داخل بعضها البعض. في الزاوية اليمنى، والبولي بروبلين بيرس 7-0 عن طريق السفينة على الجانب الكسب غير المشروع إلى الخارج. المقبل، خياطة الصف الأمامي من الخارج، من اليمين إلى اليسار، مع ما يقرب من 10 غرزة (الشكل 11D). قبل الانتهاء من الصف الأمامي، مع تدفق داخل حل قارع الأجراس أفرز اللبن لإزالة فقاعات الهواء. جعل غرزة الماضي في الصف الأمامي أقرب ماممكن للخياطة البقاء في الزاوية اليسرى، ثم ربطها معا. لإعادة إعمار الوريد البابي بواسطة تقنية صفعة (الشكل 12): سحب الفص الجانبي الأيسر ومتوسط التصاعدي مع مسحة الشاش الرطب. المشبك الوريد البابي المتلقي في التقائه مع الوريد البواب باستخدام المتاح المشبك السفينة الصغيرة من اليمين. إصلاح ملقط البعوض أن المشابك الوريد البابي في الطين، وسحب ملقط غيض من نحو نقير الكبد (الشكل 12A، ب). شق الجدار الأمامي للالوريد البابي أسفل الفك من ملقط البعوض. غسل داخل الوريد البابي والمتلقي الكفة مع حل رينغر أفرز اللبن. عقد الجدار الأمامي للشق مع ملقط الصغر على التوالي في اليد اليسرى وامتدادا لصفعة مع ملقط المنحني الصغر في اليد اليمنى. إدراج صفعة في الوريد البابي المتلقي عميقا، وضمان الحصول عليها معكفافي خيط الحرير 6-0 (الشكل 12C-F). الافراج عن المشابك من الوريد البابي وSHVC، ثم reperfuse الكبد. إزالة الحقنة 5-مل من الجزء الخلفي من الفئران، وزيادة تركيز isoflurane إلى المجلد٪ 0.8. لإعادة بناء الشريان الكبدي بواسطة تقنية الدعامات 16 (الشكل 13): أولا، حافظ على إبقاء الموضوع من الشريان الكبدي السليم المتلقي بواسطة الملقط البعوض من الجانب الأيسر، وتسحبه نحو نقير الكبد، ومن ثم المشبك CHA المستلم من الجانب الأيمن إلى إغلاق البنكرياس (الشكل 13A). مع ملقط الصغر على التوالي، وجعل شق صغير في التشعب من هيكل-Y في نهاية CHA المتلقي لجعل فتحة على شكل قمع. عقد الدعامات وضعها في CHA الكسب غير المشروع مع ملقط المنحني الصغر. بعد غسل كل تجويف مع الهيبارين صوديوم حل-(100 وحدة دولية / مل)، حرك الدعامات في إعادةCHA cipient وضمان الحصول عليها مع خيط الحرير 6-0. ربط واحدة من نهاية هذا الموضوع على CHA المتلقي والموضوع 4-CHA ملم على الكسب غير المشروع معا حتى أن كلا من شاس الاقتراب من بعضها البعض مع خفض التوتر من موقع تفاغري (الشكل 13B). بعد ذلك، حرر المشبك. لمفاغرة من IHVC من قبل خياطة مستمرة (الشكل 14): يفاغر في نفس منوال لSHVC، ولكن مع استخدام المزيد من غرز دغة فاينر (الشكل 14A-D). يمكن التخلص من ربط الخيوط الجراحية في غرزة الماضي، أو يمكن تحقيق التعادل مع عامل النمو لتجنب تضيق تفاغري الناجمة عن ربط محكم جدا. بعد إزالة الملقاط، وزيادة تركيز التخدير ل٪ المجلد 1.0. إذا كان يبدو مفاغرة تضيقي، تمدد موقع تفاغري عن طريق سحب خيوط إقامة ثنائية أو توسيع الصف الأمامي بلطف لتوسيع مفاغرة. 0.5 مل من إدارة 8.4٪ محلول بيكربونات الصوديومن مع 1.0 مل من محلول رينجر أفرز اللبن عن طريق الوريد. تطبيق شظايا صغيرة من Tachosil لاغلاق سطح الكبد مقطوعة لمنع النزيف والتسرب الصفراوي. لإعادة بناء القناة الصفراوية بواسطة تقنية الدعامات: عقد الموضوع للمتلقي القناة الصفراوية بواسطة الملقط البعوض من الجانب الأيسر. إصلاح ملقط البعوض في الطين، وسحب ملقط غيض من نحو نقير الكبد. إجراء شق صغير في القناة الصفراوية على المستوى المناسب بحيث القناة الصفراوية مجددة لن تكون طويلة جدا. إدراج الدعامات وضعها في القناة الصفراوية الكسب غير المشروع في القناة المتلقي مع عناية فائقة لتجنب تطور، وضمان الحصول عليها مع خيط الحرير 6-0. ربط هذا الموضوع في القناة والمتلقي الموضوع 4-ملم على القناة الكسب غير المشروع معا بحيث كل القنوات الاقتراب من بعضها البعض مع انخفاض حدة التوتر من موقع تفاغري. عند الانتهاء من إجراءات إعادة الإعمار، وضخ 1 ملتر من محلول الجلوكوز 5٪ في الوريد (الشكل 15). تأكيد الإرقاء كافية، ثم قم بإغلاق شق البطن بواسطة خيوط المستمر Vicryl 4-0 في طبقتين. 6. ما بعد الجراحة العلاج ومتابعة فورا بعد العملية، علاج الفئران المتلقية مع الحقن تحت الجلد من الصوديوم سيفوروكسيم (16 ملغ / كغ) والبوبرينورفين (0.1 مجم / كجم) في ما مجموعه 1.5 مل من محلول ملحي. السماح للفئران لاسترداد لمدة 60 دقيقة في قفص خاص العناية المركزة وحدة حرارة الهواء مع (30-35 ° C) وامدادات الاوكسجين. حقن البوبرينورفين (0.1 مجم / كجم) تحت الجلد بمثابة مسكن كل 12 ساعة لمدة 3 أيام. نقل بعد ذلك إلى الفأر قفص العادي، وتوفير الوصول الإعلان باستمرار طيلة فترة التجربة على الماء والغذاء.
Representative Results
نجا جميع الفئران المتلقية (ن = 20) من دون مضاعفات واضحة حتى القتل الرحيم التخطيط لأخذ عينات الدم في ساعة 1، 3، 24، و 168 (7 أيام) بعد ضخه بوابة (ن = 5 في كل نقطة زمنية). تم جمع عينات الدم من IHVC من ثقب إبرة مباشرة مع 27-قياس. بعد الطرد المركزي في 5340 x ج لمدة 10 دقيقة، تم الحصول على عينات مصل الدم وتحليلها لمستويات ألانين (ALT) الألانين، والتي تعكس درجة الضرر الكبد بعد الزرع. يظهر الوقت أثناء التغيرات في مستويات المصل ALT في الشكل 16. وصلت إلى مستويات ALT ذروتها في 24 ساعة (يعني ± الانحراف المعياري: ± 212،6 67،9 IU / L) وبعد ذلك رفض ضمن الحدود الطبيعية ب 168 ساعة (33.6 ± 6.8 وحدة دولية / لتر). الشكل 1. A صفعة للالوريد البابي (PV) من (أ) 14-قياس القسطرة، والدعامات للشريان الكبدي (HA) والقناة الصفراوية (BD) في الفترة من 24 عيار القسطرة. الشكل 2. مخطط إزالة الكبد من الفئران المانحة BD، القناة الصفراوية؛ HA، الشريان الكبدي؛ IHVC، infrahepatic الوريد الأجوف؛ PV، الوريد البابي؛ SHVC، فوق الكبد الوريد الأجوف. الشكل 3. المانحة العملية. أ. يتم وضع الفئران على وسادة التدفئة مع نظام المغناطيسي تراجع التبعي. يتم فتح البطن من قبل شق خط الوسط مع ملحقات الثنائية. ب. الإدراج من الدعامات في القناة الصفراوية. ج. الإرواء في الكبد عن طريق الوريد البابي. الاختصارات هي شرحإد في الشكل 2. الشكل 4. المرفقات من صفعة إلى الوريد البابي. أ، ب. يتم وضع المشبك بلدغ ديباكي أن القبضات الجذع الوريدي خلال بوابة كأس المعادن. هي التي شنت الكأس في علبة بلاستيكية مليئة الثلج المجروش. ج. يتم وضع الوريد البابي من خلال الكفة. د. ومقلوبة وجدار الوريد البابي على الكفة مع الجذع من الوريد الطحالي خارج صفعة في ال 7 الساعة موقف وامتدادا لصفعة في موضع الساعة 12. ه. يتم تأمين الوريد البابي مع الموضوع كفافي الحرير 6-0 على الكفة. الأسهم السوداء تشير إلى جدعة من الوريد الطحالي. الشكل 5. خارج الجسم إدخال دعامة في الشريان الكبدي. أ. يتم إصلاح الكبد عن طريق لقط كل حواف الحجاب الحاجز، ويتم سحبها مباشرة الشريان الكبدي من خلال عقد لligated الموضوع الشريان. ب. ويقام الجدار الأمامي للشق صغير في الشريان الكبدي مع ملقط الصغر على التوالي ج، د. يتم إدراج الدعامات في الشريان الكبدي وتأمين بخيط الحرير 6-0. الشكل 6. مخطط الجسم الحي السابقين استئصال الكبد 50٪. تتم إزالة فصوص في اللون الرمادي. ACL، الأمامي الفص المذنب؛ PCL، الفص الخلفي المذنبة؛ LLL، الفص الجانبي الأيسر. LML، الجزء الأيسر من الفص المتوسط؛ RML، الجزء الأيمن من الفص المتوسط؛ SRL، متفوقة الفص الجانبي الأيمن.، أدنى الحق الفص الجانبي IRL. <p class= "jove_content" fo: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> الشكل 7. خارج الجسم استئصال الكبد 50٪. وربط. ربط من عنيق من الفص الخلفي المذنبة. ب. من عنيق من الجزء الأيسر من الفص المتوسط. ج. الكبد قبل استئصال 50٪. د. وبعد استئصال الكبد 50٪. الشكل 8. خارج الجسم رأب من فوق الكبد الوريد الأجوف. أ. يتم إصلاح الكبد عن طريق لقط كل حواف الحجاب الحاجز مع ملقط البعوض. ب. الإقامة خيوط البولي بروبيلين مع 7-0 وترد على كل من الزوايا. <img alt="الشكل 9" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4376/4376fig9highres.jpg" srج = "/ files/ftp_upload/4376/4376fig9.jpg" /> الشكل 9. يتم تنفيذ مخطط زرع الفساد في الفئران المتلقية. وإجراءات لإعادة الإعمار وفوق infrahepatic الوريد الأجوف (SHVC وIHVC) مع خياطة 7-0 المستمر، والوريد البابي (PV) من خلال تقنية الكفة، والكبد في الشريان (HA) والقناة الصفراوية (BD) من خلال تقنية الدعامات. الشكل 10. عملية المتلقي حتى إزالة الكبد الأصلية. أ. يتم فتح البطن من قبل شق خط الوسط. ب. يتم ligated وريد الحق الكظرية. ج. ورفعه الكبد الأصلي. وأوضح المختصرات في الشكل 2. الشكل 11. مفاغرة من suprahepatic الوريد الأجوف. أ، ب. تم إصلاح المشبك الأوعية الدموية المحيطية لفوق الكبد الوريد الأجوف في قطعة من الطين التي تعتمد على النفط. يتم الاحتفاظ الغرز البقاء في كل زوايا مع الجر لطيف superiolaterally لتوسيع مفاغرة. ج. خياطة داخل اللمعة المستمر من الصف الخلفي في التقدم. د. خياطة المستمر من الصف الأمامي في التقدم. الشكل 12. إعادة بناء الوريد البابي. يتم إصلاح أ، ب. وملقط البعوض لقط الوريد البابي في الطين التي تعتمد على النفط وسحبت نحو نقير الكبد. راجع ادراج صفعة في الوريد البابي. الشكل 13. إعادة بناء الشريان الكبدي. أ، ب. </stron> ادراج دعامة الشريان الكبدي إلى المتلقي المشترك (CHA) في التشعب من الشريان الكبدي السليم (PHA) والشريان المعدي الاثناعشري (GDA). الشكل 14. مفاغرة من infrahepatic الوريد الأجوف. وضخه. والغرز البقاء في كل الزوايا. ب. خياطة المستمر من الصف الخلفي. ج. خياطة المستمر من الصف الأمامي. د. من infrahepatic الوريد الأجوف. وأوضح المختصرات في الشكل 2. الانتهاء من الشكل 15. جميع الإجراءات إعادة الإعمار. وأوضح المختصرات في الشكل 2. "الرقم 16" SRC = "/ files/ftp_upload/4376/4376fig16.jpg" /> الشكل 16 ما بعد الجراحة وقتا بالطبع التغيرات في مستويات مصل ألانين (ALT) الألانين (ن = 20، ن = 5 في كل نقطة زمنية). يتم التعبير عن البيانات كوسيلة مع أشرطة الخطأ التي تشير إلى الانحرافات المعيارية. وصلت إلى مستويات ALT ذروتها في 24 ساعة (212.6 ± 67.9 IU / L) وبعد ذلك رفض ضمن الحدود الطبيعية ب 168 ساعة (33.6 ± 6.8 وحدة دولية / لتر).
Discussion
وذكرت والنموذج الأول من الجرذان بواسطة OLT لي وآخرون في عام 1973 9، الذي تم بناؤه جميع السفن بما في ذلك عن طريق الشريان الكبدي طريقة اليد مخيط واستخدم تحويلة بوابية خارج الجسم. وكان هذا النموذج معقدة وصعبة من الناحية الفنية لتنفيذ. كان النموذج التالي واحد دون إعادة الإعمار كبدي الشرايين وتحويلة خارج الجسم، التي وضعها الكتاب نفسه 10 في عام 1975. في وقت لاحق في عام 1979، قدم Kamada وآخرون تقنية مفاغرة صفعة لنموذج دون rearterialization الكبد 11. مع هذه التعديلات، تم تبسيط OLT في الفئران مع الوقت anhepatic تقصير في عمليات المتلقي واستخدمت على نطاق واسع كنموذج تجريبي المقبولة.
ومع ذلك، كان هناك جدل كبير منذ ذلك الحين على أهمية arterialization الكبد في الفئران OLT 8 لأن في arterialization كانت مهمة شاقة ولكن ديد لا تؤثر على بقاء بعد الزرع. تم الإبلاغ عن العديد من الدراسات على arterialization الكبد باستخدام تقنيات مختلفة إعادة الإعمار 8، مثل مفاغرة الجزء إلى الشريان الأبهر الأورطي 3،9،17، وهي تقنية مفاغرة صفعة 18،19،20، وهي تقنية تصغير 5، تقنية الدعامات 13، 16، وتقنية مفاغرة كم 12،21-23. في حين أن تقنية لOLT الفئران لا يزال غير موحد اليوم، وقد فضلت النموذج arterialized بشكل متزايد من حيث تفوقها الفسيولوجية 8،12،13،14. بين التقنيات المذكورة أعلاه، ذكر تقنية الدعامات التي كانت بسيطة وسريعة لأداء ليمان وآخرون 16 في عام 2005. وأظهرت الدراسة نتائج ممتازة: لم يلاحظ أي معدل انسداد في الشريان الكبدي أعيد بناؤها في 8 ساعات، 24 ساعة، وبعد 6 أشهر ضخه. ولذلك اعتمدنا هذه التقنية لarterialization الكبد.
نحن ادائهاأماه ناحية مخيط مفاغرة لإعادة بناء SHVC وIHVC. يوفر هذا الأسلوب موقع تفاغري مع حالة الفسيولوجية والأمثل، مما يؤدي إلى خفض معدل الإصابة بتجلط 8، والمحاكاة هو أفضل المجهرية والتدريب للجراحين. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للمفاغرة يكون ممكنا حتى مع جذوعها سفينة قصيرة. وفيما يتعلق مفاغرة من IHVC، وهذه الطريقة لا تتطلب IHVC طويلة على الجانب الكسب غير المشروع مقارنة مع تقنية مفاغرة الكفة. لذلك، عندما يتم تشريح الوريد الكلوي المانحة لجعل الكسب غير المشروع IHVC طويلة، وهذه الطريقة تنطبق على زرع طعم الصغيرة التي يستوجب IHVC طويلة، مثل الكسب غير المشروع 30٪ يتكون من فصوص الجانبية اليمنى والمذنبة مع قصيرة داخل الكبد الوريد الأجوف دون SHVC 2.
فيما يتعلق تقنيات استئصال الكبد في الفئران، حتى الآن العديد من الطرق تم الإبلاغ؛ الطريقتين الرئيسية هي ربطة الشامل الكلاسيكية تقنيةوهذه التقنية موجهة نحو السفينة 24. ونحن أداء تقنية ربطة الكلاسيكية لاستئصال الكبد 50٪ 15، ولكن تحت المجهر الجراحي لجعل أدق الداخلي، وتجنب الأضرار التي لحقت فصوص المتبقية والهياكل.
صفنا نتائج ممثل من الفئران المتلقية في نموذجنا، والفئران على قيد الحياة خلال فترة الملاحظة لمدة 7 أيام من دون مضاعفات واضحة. يمكن تعديل النموذج لأغراض مختلفة من التجارب عن طريق اختيار إعدادات مختلفة، مثل التخزين البارد لفترات طويلة، نقص التروية الدافئ لفترة طويلة يتضمن التبرع بعد الوفاة القلبية، واستخدام الطعوم أصغر الكبد أو ترقيع من نماذج تجريبية لإصابة الكبد أو الأمراض.
في تجربتنا، وهناك ثلاثة عوامل رئيسية في جميع أنحاء الإجراءات التي يمكن أن تؤثر على بقاء بعد زرع، المعلمة الأكثر موثوقية لنتائج OLT الفئران: كمية فقدان الدم، وعملية الوقت، هلقط خصيصا الوقت من الوريد البابي وIHVC، ومدى كفاية إعادة بناء كل سفينة، مما قد يؤدي إلى تخثر الدم، تضيق، أو نزيف. في فترة التدريب لهذا النموذج يمكن، وربما معظم حالات الفشل تكون ذات صلة لتلك العوامل. في هذه المقالة الفيديو، نقدم خطوة بخطوة تعليمات لعمليات جراحية لدينا نموذج الفئران من OLT جزئية مع إعادة الإعمار كبدي الشرايين. بينما معقد نموذج الفئران من OLT ويتطلب مهارات متقدمة المجهرية، وهذه المادة يوفر الكثير من المعلومات العملية، والتي ينبغي أن تكون بمثابة دليل جيد لتدريب والتعلم من هذا النموذج. تعلم هذا النموذج بكفاءة أهمية خاصة لتقصير فترة التعلم، والحد من عدد من الحيوانات والتكاليف اللازمة لممارسة واستنساخ نتائج موثوقة في وقت لاحق في التجارب. وهذا يتماشى مع مفهوم 3Rs (استبدال، والحد، وصقل) من التجارب على الحيوانات، الذي كان يفترض من قبل رسل وبورش في1959 25.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أشكر المؤلفين باسكال وPaschenda شولتز ماركيه على مساعدتهم التقنية.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Yorumlar |
| Surgical microscope | Leica | M651 | |
| Light source | Schott | KL1500LCD | |
| Cotton swabs | NOBA Verbandmittel | 974202 | |
| Gauze swabs (5×5 cm) | Fuhrmann | 10002 | |
| povidone-iodine solution | Mundipharma | 6108022.00.01 | |
| Oil-based clay | Debika corporation | 090148 | |
| TachoSil | Takeda Pharmaceuticals International GmbH | EU/1/04/277/001-004 | Applied to resected liver surface |
| Scalpel blade No. 11 | Pfm medical | 200130011 | Preparation of cuff and stents |
| 14-gauge catheter | B. Braun | 4268210S | Cuff for PV |
| 18-gauge catheter | B. Braun | 4268130S | Perfusion via PV |
| 24-gauge catheter | B. Braun | 4269071S | Stent for BD and HA |
| 4-0 silk suture | Resorba | H3F | Liver resection |
| 6-0 silk suture | Resorba | H1F | |
| 7-0 Prolene (polypropylene) suture | Ethicon | 8701H | SHVC and IHVC |
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | V304H | Abdominal closure |
| 5-ml syringe | Terumo | SS+T05ES1 | Back pillow |
| Heating pad | Thermo | 190 x 260 mm | |
| Magnetic fixator retraction system | Fine Science Tools Inc. | 18200-01 18200-02 18200-03 18200-12 |
|
| Cold water bath | Huber | 740.000X | Graft preservation |
| Bipolar forceps | Söring | MBC-200 | |
| Mosquito forceps | BONIMED | 451-476-03 | Two pairs used |
| Adson micro forceps | Dimeda | 10.176.12 | |
| Curved micro forceps | AESCULAP | FD281R | |
| Straight micro forceps | Bonimed | 451-476-03 | |
| Curved micro scissors | Medicon | 05.15.83 | |
| Straight micro scissors | AESCULAP | FD12 | Fine incision |
| Scissors | AESCULAP | BC211W | |
| Micro needle holder | AESCULAP | FD241R | Reconstruction |
| Mayor-Hegar Needle holder | Mizuho Ikakogyo | 06-798-00 | Abdominal closure |
| DeBakey Bulldog clamp (straight) | ULRICH | CV3054 | |
| DeBakey Bulldog clamp (curved) | CODMAN | 37-1062 | |
| Satinsky clamp | Mizuhoika | 09-230-24 | |
| Peripheral vascular clamp | Teleflex Medical | 353494 | Recipient SHVC |
| Micro vessel clamp (disposable) | AROSurgical Instruments Corporation | TKM-1-60 g | PV, graft IHVC, and recipient HA |
| Micro vessel clamp (metal) | Fine Science Tools Inc. | 18052-01 | Recipient IHVC |
| Lactated Ringer solution | Fresenius Kabi | 6150917.00.00 | |
| Normal saline solution | DeltaSelect | 1299.99.99 | |
| HTK solution | Dr. Franz Köhler Chemie GmbH | 31268.00.00 | Preservation solution |
| Heparin-Natrium | Ratiopharm | 5394.02.00 | 500 IU before graft perfusion |
| 8.4% sodium bicarbonate | Fresenius Kabi | 4399.97.99 | 0.5 ml after reperfusion |
| 5% Glucose solution | B. Braun | 6714567.06.00 | 1.0 ml after reperfusion |
| Cefuroxim sodium | Fresenius Kabi | 38985.01.00 | Antibiotic, 16 mg/kg |
| Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | Painkiller, 0.1 mg/kg |
| Intensive Care Unit Cage | Brinsea Products Ltd. | Vetario S10 | Postoperative care |
Referanslar
- Puhl, G., et al. Low viscosity histidine-tryptophan-ketoglutarate graft flush improves subsequent extended cold storage in University of Wisconsin solution in an extracorporeal rat liver perfusion and rat liver transplantation model. Liver Transpl. 12, 1841-1849 (2006).
- Yagi, S., et al. Improved Preservation and Microcirculation with POLYSOL After Partial Liver Transplantation in Rats. J Surg Res. 167, e375-e383 (2011).
- Engemann, R., Ulrichs, K., Thiede, A., Muller-Ruchholtz, W., Hamelmann, H. Value of a physiological liver transplant model in rats. Induction of specific graft tolerance in a fully allogeneic strain combination. Transplantation. 33, 566-568 (1982).
- Sumimoto, R., Shinomiya, T., Yamaguchi, A. Influence of hepatic arterial blood flow in rats with liver transplants. Examination of donor liver-derived serum class I MHC antigen in rats with liver transplants with or without hepatic arterial reconstruction. Transplantation. 51, 1138-1139 (1991).
- Chaland, P., et al. Orthotopic liver transplantation with hepatic artery anastomoses. Hemodynamics and response to hemorrhage in conscious rats. Transplantation. 49, 675-678 (1990).
- Imamura, H., Rocheleau, B., Cote, J., Huet, P. M. Long-term consequence of rat orthotopic liver transplantation with and without hepatic arterial reconstruction: a clinical, pathological, and hemodynamic study. Hepatology. 26, 198-205 (1997).
- Zhong, Z., Theruvath, T. P., Currin, R. T., Waldmeier, P. C., Lemasters, J. J. NIM811, a mitochondrial permeability transition inhibitor, prevents mitochondrial depolarization in small-for-size rat liver grafts. Am. J. Transplant. 7, 1103-1111 (2007).
- Spiegel, H. U., Palmes, D. Surgical techniques of orthotopic rat liver transplantation. J. Invest. Surg. 11, 83-96 (1998).
- Lee, S., Charters, A. C., Chandler, J. G., Orloff, M. J. A technique for orthotopic liver transplantation in the rat. Transplantation. 16, 664-669 (1973).
- Lee, S., Charters, A. C., Orloff, M. J. Simplified technic for orthotopic liver transplantation in the rat. Am. J. Surg. 130, 38-40 (1975).
- Kamada, N., Calne, R. Y. Orthotopic liver transplantation in the rat. Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage. Transplantation. 28, 47-50 (1979).
- Howden, B., Jablonski, P., Grossman, H., Marshall, V. C. The importance of the hepatic artery in rat liver transplantation. Transplantation. 47, 428-431 (1989).
- Gao, W., Lemasters, J. J., Thurman, R. G. Development of a new method for hepatic rearterialization in rat orthotopic liver transplantation. Reduction of liver injury and improvement of surgical outcome by arterialization. Transplantation. 56, 19-24 (1993).
- Zhao, D., Zimmermann, A., Wheatley, A. M. Morphometry of the liver after liver transplantation in the rat: significance of an intact arterial supply. Hepatology. 17, 310-317 (1993).
- Omura, T., Ascher, N. L., Emond, J. C. Fifty-percent partial liver transplantation in the rat. Transplantation. 62, 292-293 (1996).
- Lehmann, T. G., Bunzendahl, H., Langrehr, J. M., Neuhaus, P. Arterial reconstruction in rat liver transplantation–development of a new tubing technique of the common hepatic artery. Transpl. Int. 18, 56-64 (2005).
- Reck, T., et al. Impact of arterialization on hepatic oxygen supply, tissue energy phosphates, and outcome after liver transplantation in the rat. Transplantation. 62, 582-587 (1996).
- Hasuike, Y., et al. A simple method for orthotopic liver transplantation with arterial reconstruction in rats. Transplantation. 45, 830-832 (1988).
- Steffen, R., Ferguson, D. M., Krom, R. A. A new method for orthotopic rat liver transplantation with arterial cuff anastomosis to the recipient common hepatic artery. Transplantation. 48, 166-168 (1989).
- Knoop, M., Bachmann, S., Keck, H., Steffen, R., Neuhaus, P. Experience with cuff rearterialization in 600 orthotopic liver grafts in the rat. Am. J. Surg. 167, 360-363 (1994).
- Hickman, R., Engelbrecht, G. H., Duminy, F. J. A technique for liver transplantation in the rat. Transplantation. 48, 1080 (1989).
- Liu, T., Freise, C. E., Ferrell, L., Ascher, N. L., Roberts, J. P. A modified vascular “sleeve” anastomosis for rearterialization in orthotopic liver transplantation in rats. Transplantation. 54, 179-180 (1992).
- Li, J., et al. Modified sleeve anastomosis for reconstruction of the hepatic artery in rat liver transplantation. Microsurgery. 22, 62-68 (2002).
- Martins, P. N., Theruvath, T. P., Neuhaus, P. Rodent models of partial hepatectomies. Liver Int. 28, 3-11 (2008).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. . The Principles of Humane Experimental Technique. , (1992).
Etiketler
Surgical ProceduresRat ModelPartial Orthotopic Liver TransplantationHepatic Arterial ReconstructionTransplantation ResearchGraft PreservationIschemia-reperfusion InjuryImmunological ResponsesHemodynamicsSmall-for-size SyndromeDifficult Animal ModelMicrosurgical SkillsReliabilityReproducibilityStandardized ProceduresSophisticated ProceduresHepatic Arterial Reconstruction EliminationCuff Anastomosis TechniqueKamada Et Al.Hepatic Rearterialization Elimination
Bu Makaleden Alıntı Yapın
Nagai, K., Yagi, S., Uemoto, S., Tolba, R. H. Surgical Procedures for a Rat Model of Partial Orthotopic Liver Transplantation with Hepatic Arterial Reconstruction. J. Vis. Exp. (73), e4376, doi:10.3791/4376 (2013).