Özet

Gravação Intracelular simultânea de um motoneurônio lombar e a força produzida pelo seu motor no Rato Adulto<em> Em vivo</em

Published: December 05, 2012
doi:

Özet

Este método novo permite a gravação simultânea intracelular de um motoneurônio único adulto rato e a medição da força produzida por suas fibras musculares. A investigação combinado das propriedades eléctricas e mecânicas das unidades motoras em animais normais e geneticamente modificadas é um avanço para o estudo do sistema neuromuscular.

Abstract

O motoneurônio espinhal tem sido um sistema modelo bom para estudar a função neural, porque é um neurónio do sistema nervoso central, com as propriedades únicas de (1) tendo alvos prontamente identificáveis ​​(fibras musculares) e, portanto, tem uma função bem conhecido (para controlar a contracção muscular), (2) ser o alvo convergente de muitas redes e descendente da coluna vertebral, daí o nome de "via comum final", e (3), com uma soma grande que faz com que seja possível a penetração los com afiadas eletrodos intracelulares . Além disso, quando estudados in vivo, é possível gravar, simultaneamente, a actividade eléctrica dos motoneurónios e da força desenvolvida pelo músculo seus alvos. Realizando gravações intracelulares de motoneurónios in vivo, por conseguinte, colocar o experimentalista, na posição única de ser capaz de estudar, ao mesmo tempo, todos os compartimentos da "unidade motora" (o nome dado à motoneurónio, do seu axónio, eas fibras musculares que inerva 1): Os insumos que incidem sobre o motoneurônio, as propriedades eletrofisiológicas do motoneurônio, eo impacto destas propriedades em função fisiológica dos neurônios motores, ou seja, a força produzida por seu motor. No entanto, esta abordagem é muito difícil, porque a preparação não pode ser paralisado e, assim, a estabilidade mecânica para a gravação intracelular é reduzida. Assim, este tipo de experiências só foi alcançado em gatos e em ratos. No entanto, o estudo dos sistemas motores espinais poderia fazer um salto formidável se que era possível realizar experiências semelhantes em ratinhos normais e geneticamente modificados.

Por razões técnicas, o estudo das redes espinhal em ratos, principalmente se limitado a neonatal em preparações in vitro, onde os neurônios motores e as redes espinhal são imaturos, os neurônios motores são separados de suas metas, e quando estudado em fatias, o MOtoneurons são separadas a maior parte das suas entradas. Até recentemente, apenas alguns grupos conseguiram realizar gravações intracelulares de motoneurônios in vivo 2-4, incluindo a nossa equipe, que publicou uma nova preparação que nos permitiu obter gravações muito estáveis ​​de motoneurônios in vivo em camundongos adultos 5,6. No entanto, estas gravações foram obtidos em animais paralisados, isto é, sem a possibilidade de gravar a saída força destes neurónios motores. Aqui apresentamos uma extensão da preparação original em que fomos capazes de obter gravações simultâneas das propriedades eletrofisiológicas das motoneurônios e da força desenvolvida por seu motor. Esta é uma conquista importante, pois nos permite identificar os diferentes tipos de neurônios motores com base no seu perfil de força, e revelando assim a sua função. Juntamente com modelos genéticos perturbar circuito segmentar vertebral 7-9, ou reproduzindo doen humanaSE 10,11, esperamos que esta técnica para ser uma ferramenta essencial para o estudo do sistema motor espinhal.

Protocol

1. Um passo Medicação pré-anestésica: 10-15 min antes da indução de anestesia, injetar atropina (0,20 mg / kg) e methylprenidsolone (0,05 mg) subcutaneamente para evitar salivação e edema, respectivamente. 2. Passo dois Indução da anestesia: injectar pentobarbital sódico (70 mg / kg) ou de uma mistura de cetamina / xilazina (100 mg / kg e 10 mg / kg, respectivamente), intraperitonealmente. Deixe o rato ir até sob nenhum reflex…

Representative Results

A Figura 1 mostra como identificar um motoneurônio do grupo tríceps sural após a penetração. Em intensidade de estimulação baixo, apenas uma EPSP monossináptico pode ser observado (Figura 1A). Com maior intensidade, o EPSP pode ser suficientemente grande para provocar uma "ortodrómica" pico (Figura 1B). Em intensidade de estimulação ainda maior, um tudo-ou-nada antidrômica espiga aparecer, com uma latência mais curta do que o EPSP monossináptico …

Discussion

A preparação descrita aqui é o primeiro que permite, no rato adulto, a gravação simultânea intracelular de um motoneurônio lombar e a medição da força produzida pelas fibras musculares inervadas por seu axónio.

Devido ao pequeno tamanho do animal, as técnicas cirúrgicas necessárias para esta preparação pode ser um desafio para adquirir. No entanto, uma vez que essas capacidades são dominados, a cirurgia inteira pode ser realizada em três horas, e os animais podem sobreviver…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi possível graças ao apoio financeiro da Fondation pour la Recherche Médicale (FRM), o Milton bolsa de pós-doutorado Safenowitz para a pesquisa de ALS (ALS Association), Grants NIH NINDS NS05462 e NS034382, e Grant ANR HyperMND.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Atropine sulfate Aguettant
Methylprenidsolone Pfizer Solu-Medrol
Sodium pentobarbitone Sanofi-Aventis Pentobarbital
Ketamine
Xylazine
Glucose
Plasma expander Roger Bellon Plasmagel
Blunt scissors FST 14079-10
Blunt fine scissors FST 15025-10
Vannas Spring Scissors FST 15002-08
Fine forceps serrated FST 11370-32
Fine forceps serrated FST 11370-31
Cunningham Spinal Adaptor Stoelting Co.
Kwik-Cast sealant WPI #KWIK-CAST
Ventilator CWE Inc SAR-830/AP
Capnograph CWE Inc μcapstar
Heating blanket Harvard Apparatus 507221F
Intracellular amplifier Axon Instruments Axoclamp 2B
Pipette puller Sutter Instruments P-97
KCl Sigma-Aldrich P9333-500G

Referanslar

  1. Liddel, E. G. T., Sherrington, C. S. Recruitment and some other factors of reflex inhibition. Proc. R. Soc. London. B, 488-518 (1925).
  2. Huizar, P., Kuno, M., Miyata, Y. Electrophysiological properties of spinal motoneurones of normal and dystrophic mice. The Journal of physiology. 248, 231-246 (1975).
  3. Alstermark, B., Ogawa, J. In vivo recordings of bulbospinal excitation in adult mouse forelimb motoneurons. Journal of neurophysiology. 92, 1958-1962 (2004).
  4. Meehan, C. F., Sukiasyan, N., Zhang, M., Nielsen, J. B., Hultborn, H. Intrinsic properties of mouse lumbar motoneurons revealed by intracellular recording in vivo. Journal of neurophysiology. 103, 2599-2610 (2010).
  5. Manuel, M., et al. Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons. J. Neurosci. 29, 11246-11256 (2009).
  6. Iglesias, C., et al. Mixed mode oscillations in mouse spinal motoneurons arise from a low excitability state. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 5829-5840 (2011).
  7. Crone, S. A., Zhong, G., Harris-Warrick, R., Sharma, K. In mice lacking V2a interneurons, gait depends on speed of locomotion. J. Neurosci. 29, 7098-7109 (2009).
  8. Talpalar, A. E., et al. Identification of minimal neuronal networks involved in flexor-extensor alternation in the mammalian spinal cord. Neuron. 71, 1071-1084 (2011).
  9. Rabe, N., Gezelius, H., Vallstedt, A., Memic, F., Kullander, K. Netrin-1-dependent spinal interneuron subtypes are required for the formation of left-right alternating locomotor circuitry. J. Neurosci. 29, 15642-15649 (2009).
  10. Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).
  11. Cifuentes-Diaz, C., et al. Neurofilament accumulation at the motor endplate and lack of axonal sprouting in a spinal muscular atrophy mouse. Hum. Mol. Genet. 11, 1439-1447 (2002).
  12. Simpson, D. P. Prolonged (12 hours) intravenous anesthesia in the rat. Laboratory animal science. 47, 519-523 (1997).
  13. Burke, R. E. Motor Unit Types – Functional Specializations in Motor Control. Trends Neurosci. 3, 255-258 (1980).
  14. Kerkut, G. A., Bagust, J. The isolated mammalian spinal cord. Prog. Neurobiol. 46, 1-48 (1995).
  15. Carp, J. S., et al. An in vitro protocol for recording from spinal motoneurons of adult rats. Journal of Neurophysiology. 100, 474-481 (2008).
  16. Mitra, P., Brownstone, R. M. An In Vitro Spinal Cord Slice Preparation for Recording from Lumbar Motoneurons of the Adult Mouse. Journal of Neurophysiology. , (2011).
  17. Husch, A., Cramer, N., Harris-Warrick, R. M. Long duration perforated patch recordings from spinal interneurons of adult mice. Journal of Neurophysiology. , (2011).
  18. Manuel, M., Zytnicki, D. Alpha, beta and gamma motoneurons: functional diversity in the motor system’s final pathway. J. Integr. Neurosci. 10, 243-276 (2011).
  19. Nakanishi, S. T., Whelan, P. J. A decerebrate adult mouse model for examining the sensorimotor control of locomotion. Journal of Neurophysiology. 107, 500-515 (2012).
  20. Meehan, C. F., Grondahl, L., Nielsen, J. B., Hultborn, H. Fictive locomotion in the adult decerebrate and spinal mouse in vivo. The Journal of Physiology. 590, 289-300 (2012).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Manuel, M., Heckman, C. Simultaneous Intracellular Recording of a Lumbar Motoneuron and the Force Produced by its Motor Unit in the Adult Mouse In vivo. J. Vis. Exp. (70), e4312, doi:10.3791/4312 (2012).

View Video