Zebrafish representam um modelo de vertebrados poderosa que tem sido sub-utilizado para estudos metabólicos. Aqui descrevemos uma forma rápida para medir a<em> In vivo</em> Perfil metabólico de zebrafish desenvolvimento que permite a comparação dos diferentes parâmetros da função mitocondrial entre geneticamente ou farmacologicamente embriões manipulados, aumentando assim a aplicabilidade deste organismo.
A meta de crescimento no campo do metabolismo é determinar o impacto da genética em diferentes aspectos da função mitocondrial. Compreender essas relações vão ajudar a entender a etiologia subjacente para uma série de doenças relacionadas à disfunção mitocondrial, como diabetes e obesidade. Os recentes avanços na instrumentação, tem permitido o monitoramento de parâmetros distintos de função mitocondrial em linhas de células ou explantes de tecido. Aqui apresentamos um método para uma análise rápida e sensível de parâmetros da função mitocondrial in vivo durante o desenvolvimento embrionário zebrafish utilizando o cavalo marinho de biociências XF 24 analisador de fluxo extracelular. Este protocolo utiliza o Captura Islet microplacas onde um único embrião é colocado em cada cavidade, o que permite a medição da bioenergética, incluindo: (i) a respiração basal, (ii) da respiração mitocondrial respiração basal (iii) mitocondrial devido à rotação de ATP, (iv) mitocondrial respiração desacoplado ou prOton vazamento e (iv) a respiração máxima. Utilizando esta abordagem parâmetros da respiração zebrafish embrionárias podem ser comparadas entre o tipo selvagem e os embriões geneticamente alteradas (mutante, a sobre-expressão do gene ou gene knockdown) ou aqueles manipulado farmacologicamente. Prevê-se que a disseminação de este protocolo irá proporcionar aos investigadores novas ferramentas para analisar a base genética de doenças metabólicas in vivo neste modelo relevante vertebrado animal.
Zebrafish é um modelo bem estabelecido genético para a frente (ENU mutagénese) e reverso (Tilling, dedo de zinco nuclease específica de knock-out, knockdown morfolino) abordagens genéticas 3,4, enquanto que a função do gene em embriões de peixe-zebra também podem ser facilmente bloqueados ou activados selectivas compostos farmacológicos específicos para os produtos codificados. Devido ao seu desenvolvimento e externo pequeno tamanho, de embriões zebrafish são particularmente adequadas para análise metabólica. No entanto, a medição do perfil metabólico robusto e função mitocondrial in vivo em embriões de peixe-zebra não tenha sido alcançado, com apenas uma descrição preliminar relatada 5. Análise Seahorse foi originalmente concebido para os estudos baseados em células metabólicas e tem sido demonstrado para dar resultados precisos e fiáveis 6. A aplicação desta nova metodologia de embriões zebrafish é significativo, e provavelmente para aumentar o uso mais amplo deste modelo para estudos metabólicos.
Neste estudo, demonstramos a medição de uma série de parâmetros da respiração em embriões de peixes-zebra usando o Analisador Seahorse, incluindo respiração basal, respiração máxima, a capacidade respiratória de reposição, o volume de ATP e vazamento de prótons. Também fornecemos um exemplo de como tais medições podem ser correlacionados com outros parâmetros fisiológicos, neste caso, acumulação de lípidos e da utilização de inibidores farmacológicos neste sistema de ensaio. Combinado com o uso de embriões geneticamente alterados, isso proporciona uma poderosa plataforma experimental para a compreensão de fatores que impactam sobre o metabolismo.
Há uma variedade de aplicações para esta nova metodologia, com a disfunção mitocondrial está implicada em muitas doenças humanas, tais como Diabetes mellitus 7, obesidade 8, esclerose múltipla 9, doenças de Parkinson 10, a doença de Alzheimer 11 e algum tipo de cancros 12. É importante ressaltar que our trabalho é realizado in vivo, em que todas as influências ambientais – tais como as citoquinas, o desenvolvimento relacionado com o crescimento, etc – são activas, proporcionando assim uma vista fisiologicamente relevante na respiração vivo e metabólico. Como telas químicas também são rotineiramente realizados em tipo selvagem e mutantes de peixe-zebra embriões de fundo (Figura 1), produtos farmacêuticos novos que influenciaram a respiração, função mitocondrial ou metabolismo possam ser facilmente identificados utilizando o analisador Seahorse. Os resultados obtidos utilizando o analisador Seahorse poderia ser usado em conjunto com outros ensaios para fornecer informações adicionais. Isto pode incluir a análise fisiológico, tais como óleo de coloração vermelho-, ou a análise molecular, tais como hibridação in situ por adipócitos marcadores específicos tais como cebpα, PPARa, PPARy, etc FAS
Restam algumas limitações para esta metodologia. Embora nós e outros foram capazes de usar a medição oligomicinaure produção de ATP e de vazamento de protões em embriões jovens 5 (ver Figura 3), em embriões com mais de 60 tratamento oligomicina hpf é ineficiente. Acreditamos que em embriões mais antigos oligomicina não pode difundir tão facilmente do que em embriões jovens que fazem os resultados impossíveis de interpretar. Como os resultados oligomicina são obrigatórios para a determinação da respiração devido à ATP volume de negócios e respiração desacoplado, estamos investigando maiores concentrações de oligomicina de embriões mais velhos. No entanto, antimicina A tratamentos eficazes permanecem por mais tempo, com outras medidas, tais como a respiração basal, respiração e da capacidade respiratória máxima de reposição, podem ser realizados em embriões mais velhos zebrafish, até 68 hpf (não mostrado).
Outra limitação na utilização da configuração corrente Analyser Seahorse é o espaço físico no interior de cada uma das placas de captura de ilhota bem, de tal forma que eles só são adequados para os embriões zebrafish e larvas jovens. Portanto, a realização MetabolEstudos sobre ic obesidade induzida por dieta, em peixes adultos, por exemplo, ainda não é tecnicamente viável. No entanto, este estudo pode propiciar o desenvolvimento de placas projetadas especificamente para juvenis e adultos, ampliando assim o escopo de análises possíveis.
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de agradecer aos membros do pessoal da Facilidade Deakin University Zebrafish para a prestação de cuidados de criação excelente curso. YG é apoiado por uma Bolsa de Investigação Alfred Deakin pós-doutorado e um Grant Central de Pesquisa da Universidade Deakin. SLM é apoiado por uma Bolsa NHMRC Desenvolvimento de Carreira. ACW é apoiado por um Grant NHMRC de habilitação. Todos os autores são suportados pelo Molecular e Centro Médico de Pesquisa de Pesquisa Estratégica da Universidade Deakin.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Yorumlar |
XF 24 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | 24 well format |
Islet Capture microplate | Seahorse Bioscience | 101122-100 | 24 well format |
XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
XF Assay Medium | Seahorse Bioscience | 101022-100 | |
Oil-Red-O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml51 |
E3 (embryonic medium) | Self made | – | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16 |
100X15 mm Petri dishes | Falcon | 35-1029 | |
FCCP | Sigma | C2920 | |
Oligomycin | Sigma | 75351 | |
Antimycin A | Sigma | A8674 |