ゼブラフィッシュは、代謝の研究のために十分に利用されている強力な脊椎動物のモデルを表しています。ここでは、測定するための迅速な方法を記述<em生体内で></emそれによって、この生物の適用性を増加させる、遺伝的または薬理学的に操作された胚の間の異なるミトコンドリア機能パラメータの比較を可能にゼブラフィッシュを開発する>代謝プロファイル。
代謝の分野で成長している目標は、ミトコンドリア機能のさまざまな側面に遺伝の影響を判断することです。これらの関係を理解することは、糖尿病や肥満などのミトコンドリア機能不全と連動疾患の範囲のための基礎にある病因を理解するのに役立ちます。計装における最近の進歩は、細胞株や組織外植片のミトコンドリア機能の異なるパラメータの監視を可能にしました。ここでは、シーホースXFバイオサイエンス24細胞外フラックスアナライザーを用いてゼブラフィッシュ胚の発生過程で生体内でのミトコンドリア機能パラメータの迅速かつ高感度な分析のための方法を提示する。このプロトコルは、膵島キャプチャは単一胚を各ウェルに配置されている場合には、生体エネルギーの測定を可能にする、マイクロプレートを含む利用:基礎呼吸(i)を、ATPの代謝回転に起因する(ii)の基底ミトコンドリア呼吸(iii)のミトコンドリアの呼吸をし、(iv)ミトコンドリア切り離さ呼吸やPRoton漏れ及び(iv)の最大呼吸。このアプローチ胚ゼブラフィッシュの呼吸パラメータを使用すると、野生型および遺伝的に改変された胚(変異、遺伝子の過剰発現や遺伝子ノックダウン)またはその薬理学的に操作され、それらの間で比較することができます。それは、このプロトコルの普及はこの関連脊椎動物動物モデルにおける in vivoでの代謝性疾患の遺伝的基礎を分析するための新しいツールを研究者に提供することが予想されます。
ゼブラフィッシュ胚における遺伝子機能も簡単にブロックされたり、アクティブにすることができながら、ゼブラフィッシュは、前方(ENU誘発)とリバース(耕耘、ジンクフィンガーヌクレアーゼ標的ノックアウト、モルホリノノックダウン)遺伝的アプローチ3,4両方のための十分に確立された遺伝的モデルである符号化された製品の特定の選択的な薬理学的化合物を使用して。彼らの外部の開発と小型のため、ゼブラフィッシュ胚は、代謝解析のために特に適している。しかし、代謝プロフィールとゼブラフィッシュ胚における in vivoでのミトコンドリア機能の堅牢な計測は1つだけ予備説明と共に、達成5報告されていない。タツノオトシゴの分析は、もともと細胞ベースの代謝研究用に設計されており、正確で信頼性の高い結果6を与えることが実証されている。ゼブラフィッシュ胚には、この新しい方法論の適用が重要、と代謝研究のために、このモデルのより広い使用を増強する可能性があります。
そこで本研究では、基底呼吸、最大呼吸、呼吸予備容量は、ATPの代謝回転とプロトンリーク電流を含むタツノオトシゴアナライザーを用いて、ゼブラフィッシュ胚の呼吸パラメータの範囲の測定値を示しています。我々はまた、このような測定は、この場合の脂質の蓄積であり、このアッセイ系における薬理学的阻害剤の使用の他の生理的パラメータと相関させることができる方法の例を提供します。遺伝子組み換え胚の使用と組み合わせることで、これが代謝に影響を与える要因を理解するための強力な実験的なプラットフォームを提供します。
ミトコンドリアの機能不全は、糖尿病7、肥満8、多発性硬化症9、パーキンソン病10、アルツハイマー病11とがん12のいくつかのタイプなど、多くのヒト疾患に関与していると、この新しい方法論のための様々なアプリケーションがあります。重要なことは、Oそれによって生体の呼吸および代謝プロファイルで生理学的に関連するビューを提供する、アクティブになっている-そのようなサイトカイン、開発関連の成長などなど-ウルの仕事はすべての環境の影響は 、in vivo で行われます。などの化学画面も日常的に野生型と変異型の背景ゼブラフィッシュ胚( 図1)、影響呼吸、ミトコンドリア機能や代謝を簡単にタツノオトシゴ·アナライザを使用して識別することができることを小説医薬品で実行されます。タツノオトシゴ·アナライザを使用して生成された結果は、追加情報を提供するために、他のアッセイと組み合わせて使用することができる。これは、例えばcebpαなどの特定の脂肪細胞のマーカーのためのin situハイブリダイゼーションなどのオイルレッド染色、または分子解析、PPARα、PPARγ、FASなどの生理的な分析を含むことができ、
この方法にはいくつかの制限が残っている。我々と他の人はMEASにオリゴマイシンを使用することができたものの、60 HPFオリゴマイシンの治療よりも古い胚の若い胚5( 図3を参照)上のURE ATP生産とプロトンリークは、非効率的です。我々は古い胚でオリゴマイシンは、同じように簡単に解釈する結果は不可能若い胚に比べて拡散することができないと信じています。オリゴマイシンの結果は、ATPの代謝回転と切り離さ呼吸による呼吸の測定のための必須であるので、我々は現在、年上の胚のオリゴマイシンの高い濃度を調査している。しかし、アンチマイシン治療法は、このような基礎呼吸、最大呼吸とスペア呼吸容量、古いゼブラフィッシュ胚で行うことができ、最大68 HPF(図示せず)などの他の測定と、より長い有効のままです。
現在のタツノオトシゴアナライザーのセットアップを使用してのもう一つの制限は、ゼブラフィッシュ胚および若齢幼虫にのみ適していることなどを各ウェル膵島捕捉プレート内の物理的な空間です。したがって、metabolを行う成魚における食餌誘導性肥満のICの研究は、例えば、まだ技術的に実現不可能である。しかし、この研究では、ことが可能な分析の範囲を拡張し、特に少年又は成魚用に設計されたプレートの開発を促すことができる。
The authors have nothing to disclose.
著者らは、優れた継続的な畜産ケアを提供するためディーキン大学ゼブラフィッシュ施設のスタッフに感謝したいと思います。 YGは、アルフレッドディーキンポスドク研究フェローシップとディーキン大学から中央研究グラントでサポートされています。 SLMはNHMRCキャリア開発フェローシップでサポートされています。 ACWはNHMRC有効にグラントでサポートされています。すべての著者は、ディーキン大学の分子医療研究戦略研究センターによりサポートされています。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Yorumlar |
XF 24 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | 24 well format |
Islet Capture microplate | Seahorse Bioscience | 101122-100 | 24 well format |
XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
XF Assay Medium | Seahorse Bioscience | 101022-100 | |
Oil-Red-O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml51 |
E3 (embryonic medium) | Self made | – | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16 |
100X15 mm Petri dishes | Falcon | 35-1029 | |
FCCP | Sigma | C2920 | |
Oligomycin | Sigma | 75351 | |
Antimycin A | Sigma | A8674 |