Zebrafish rappresenta un potente modello vertebrato che è stato sotto-utilizzato per studi metabolici. Qui si descrive un metodo rapido per misurare la<em> In vivo</em> Profilo metabolico di zebrafish in via di sviluppo che permette la comparazione di diversi parametri della funzione mitocondriale tra geneticamente o farmacologicamente embrioni manipolati, aumentando in tal modo l'applicabilità di questo organismo.
Un obiettivo crescita nel campo del metabolismo è quello di determinare l'impatto della genetica su diversi aspetti della funzione mitocondriale. La comprensione di queste relazioni aiuterà a comprendere l'eziologia di fondo per una serie di malattie legate alla disfunzione mitocondriale, come il diabete e l'obesità. I recenti progressi nella strumentazione, ha permesso il monitoraggio dei parametri distinti della funzione mitocondriale in linee cellulari o espianti di tessuto. Presentiamo qui un metodo per un'analisi rapida e sensibile di parametri funzione mitocondriale in vivo durante lo sviluppo embrionale di zebrafish usando l'Seahorse Bioscience XF 24 analizzatore extracellulare flusso. Questo protocollo utilizza la cattura Islet micropiastre in cui un singolo embrione si trova in ciascun pozzetto, consente la misurazione della bioenergetica, tra cui: (i) la respirazione basale, (ii) la respirazione mitocondriale basale (iii) la respirazione mitocondriale a causa di fatturato ATP, (iv) mitocondriale respirazione disaccoppiato o prOton perdita e (iv) la respirazione massimo. Utilizzando questo approccio embrionali parametri respiratori zebrafish può essere paragonato tra wild-type e di embrioni geneticamente modificati (mutante, gene sovra-espressione o knockdown gene) o quelli manipolato farmacologicamente. Si prevede che la diffusione di questo protocollo fornirà ai ricercatori nuovi strumenti per analizzare le basi genetiche dei disturbi metabolici in vivo nel modello animale vertebrato rilevante.
Zebrafish è una consolidata modello genetico sia in avanti (ENU mutagenesi) e reverse (Tilling, zinc finger nucleasi mirata knock-out, knockdown morfolino) approcci genetici 3,4, mentre la funzione del gene in embrioni di zebrafish può anche essere facilmente bloccato o attivato utilizzando selettivi composti farmacologici specifici per i prodotti codificati. Grazie al loro sviluppo esterno e piccole dimensioni, embrioni di zebrafish sono particolarmente adatti per l'analisi metabolica. Tuttavia, la misura del profilo metabolico robusta e funzione mitocondriale in vivo in embrioni di zebrafish non è stato raggiunto, con una sola descrizione preliminari riportate 5. Analisi Seahorse stato originariamente progettato per basati su celle studi metabolici e ha dimostrato di dare risultati precisi e affidabili 6. L'applicazione di questa nuova metodologia di embrioni di zebrafish è significativo, e in grado di aumentare l'uso più ampio di questo modello per gli studi metabolici.
In questo studio, abbiamo dimostrato la misurazione di una serie di parametri di respirazione in embrioni di zebrafish utilizzando l'analizzatore Seahorse, tra cui la respirazione basale, respirazione massima, di ricambio capacità respiratoria, fatturato ATP e perdite protone. Forniamo anche un esempio di come tali misurazioni possono essere correlati con altri parametri fisiologici, in questo caso accumulo di lipidi, e dell'uso di inibitori farmacologici in questo sistema di analisi. In combinazione con l'uso di embrioni geneticamente alterati, questo fornisce una potente piattaforma sperimentale per comprendere i fattori che incidono sul metabolismo.
Ci sono una varietà di applicazioni per questa nuova metodologia, con disfunzione mitocondriale è implicato in molte malattie umane, come il diabete mellito 7, obesità 8, 9 sclerosi multipla, Parkinson 10, morbo di Alzheimer 11 e alcuni tipi di cancro 12. È importante sottolineare che, our lavoro viene eseguito in vivo, in cui tutte le influenze ambientali – quali citochine, sviluppo connesse etc crescita – sono attivi, fornendo così una vista fisiologicamente rilevante nella respirazione vivo e profilo metabolico. Come schermi chimici sono eseguiti di routine in wild type e mutanti embrioni di zebrafish sfondo (Figura 1), i prodotti farmaceutici innovativi che influenza la respirazione, la funzione dei mitocondri e metabolismo rischiano di essere facilmente identificabili con l'analizzatore Seahorse. I risultati ottenuti utilizzando l'analizzatore Seahorse potrebbe essere utilizzato in combinazione con altri saggi di fornire ulteriori informazioni. Questo può includere analisi fisiologica, come olio rosso-colorazione, o analisi molecolare, come l'ibridazione in situ per adipociti marcatori specifici come cebpα, PPARa, PPARy, ecc FAS
Restano alcune limitazioni a questa metodologia. Anche se e gli altri erano in grado di utilizzare oligomicina per misuraure produzione di ATP e perdita protonica sugli embrioni giovani 5 (vedi figura 3), in embrioni di età superiore ai 60 Trattamento hpf oligomicina è inefficiente. Riteniamo che nei vecchi embrioni oligomicina non può diffondere con la stessa facilità che nei giovani embrioni rendendo i risultati impossibili da interpretare. Dal momento che i risultati oligomicina sono obbligatori per la determinazione della respirazione a causa di fatturato ATP e la respirazione disaccoppiato, stiamo attualmente studiando concentrazioni più elevate di oligomicina per gli anziani embrioni. Tuttavia, antimicina A trattamenti rimangono più efficace, con altre misure, come la respirazione basale, respirazione massima e ricambio capacità respiratoria, può essere eseguita in embrioni di zebrafish anziani, fino a 68 HPF (non mostrato).
Un'altra limitazione utilizzando l'attuale configurazione Analyser Seahorse è lo spazio fisico all'interno di ogni piastra di cattura isolotto bene, in modo tale che essi sono adatti solo per embrioni di zebrafish e larve giovani. Pertanto, eseguendo metabolic studi sulla dieta obesità indotta nei pesci adulti, per esempio, non è ancora tecnicamente possibile. Tuttavia, questo studio possono indurre lo sviluppo di lastre appositamente studiati per il novellame o adulto, in modo da estendere l'ambito di analisi possibili.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano ringraziare i membri del personale del Fondo per la Deakin University Zebrafish per fornire un'eccellente assistenza in corso allevamento. YG è supportato da una borsa di studio di ricerca post-dottorato e Alfred Deakin un assegno di ricerca Central da Deakin University. SLM è supportato da una borsa di studio NHMRC sviluppo della carriera. ACW è sostenuta da una sovvenzione NHMRC Attivazione. Tutti gli autori sono supportati dal Molecular & Medical Research Centre di ricerca strategica presso Deakin University.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Yorumlar |
XF 24 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | 24 well format |
Islet Capture microplate | Seahorse Bioscience | 101122-100 | 24 well format |
XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
XF Assay Medium | Seahorse Bioscience | 101022-100 | |
Oil-Red-O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml51 |
E3 (embryonic medium) | Self made | – | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16 |
100X15 mm Petri dishes | Falcon | 35-1029 | |
FCCP | Sigma | C2920 | |
Oligomycin | Sigma | 75351 | |
Antimycin A | Sigma | A8674 |