斑马鱼胚胎的代谢谱分析

第1部分：化学处理的斑马鱼胚胎收集斑马鱼胚胎在受精后。孵育在28.5℃下在E3介质的100×15毫米的培养皿中。 注：如果在 原位杂交或油红O染色，1 -苯基-2 -硫脲（PTU）的最终浓度为0.2 mM的被添加到抑制色素形成1，但不是必要的海马分析。 药理研究，在适当的斑马鱼胚胎在受精后26小时左右（HPF）的终浓度为所需的化学添加一个合适的工具，唯一的控制。 注意：光敏感的药物抑制剂，胚胎可以被允许发展在分析前的暗。 第2部分：现场代谢个人使用海马XF 24分析仪每次运行前，海马XF 24分析仪墨盒，里面的O 2和H <s高达> +荧光基团是通过一个自动执行的处理的分析仪校准。 制备24孔XF 24胰岛板。采用下面的实验序列： 由于氧的消耗是敏感的温度波动，四个井，用于控制整个板的可能的温度波动。这些井的不包含胚胎，但都充满了700微升E3类介质中（ 图2A）。 余下的20井（见2.2部分）填充E3类介质和每一个胚胎（ 图2B）与700微升。 对于每个实验，10的胚胎与车辆只（对照组）和10用化学抑制剂（处理的）处理。交替控制和处理的胚胎（ 例如 A2：控制胚胎;以及A3：处理过的胚胎以及A4：控制胚胎，治疗以及A5胚胎等）。 一个小岛拍摄屏幕的顶部添加每个孔中，以确保该标本保持在整个试验中（ 图2B）的测量室。 注：化学处理的胚胎保持其原始的化学溶液在整个过程中，没有需要洗出前的化学运行Seahorse的分析仪程序。 一旦完成后，板装入Seahorse的分析仪，并开始测定。 样本分析。两种不同的检测常规进行。 的基础呼吸/最大呼吸计划（持续时间约90分钟）。基础呼吸的改变支撑，而最大的呼吸代谢功能障碍，是衡量能源生产总量的能力，在此参数与一些病理和生理状态的改变。的备用呼吸能力，或系统，以进一步提高ATP生产的能力，同时也计算出从本次测试的减法的基础，从最大的呼吸。三重复的每个组合（2分钟）/（1分钟）/测量等待周期（2分钟），先建立基础的呼吸。在第三个周期的结束，使最终浓度为2.5μM的FCCP（线粒体protonophore /解偶联剂）被添加到每个孔中允许测量的最大呼吸。然后，在测量周期重复5〜8倍（ 图3）。 ATP营业额/的质子漏程序（持续时间约60分钟）。呼吸，由于ATP营业额的主要功能，线粒体的ATP生产的形式，而由于质子漏，或脱钩呼吸呼吸，与其他参数的线粒体的功能，包括基础呼吸和活性氧物种的形成有着千丝万缕的联系。呼吸由于ATP周转后，加入25μM的寡霉素（抑制剂的A表示的呼吸中的差异TP酶）相比，基础呼吸的影响。非耦合呼吸，或呼吸由于质子泄漏，确定通过计算25μM鱼藤酮（一个复杂的I抑制剂）的添加后，寡霉素-介导的呼吸和呼吸之间的差异。每个线粒体抑制剂加入后，重复测量周期的8倍。 的运行结束时，计算平均值10控制和10个化学处理的胚胎。 第3部分：油红O染色 50斑马鱼胚胎在dechorionated用细镊子和4％PFA固定于4℃过夜进行油红O染色，如前面所述2（参见图4）。