Humanos Linhas tumor neuroendócrino de células como um modelo tridimensional para o estudo da terapia de tumores humanos Neuroendócrino

1. Preparação de 1% de agarose-revestido placa de 24 poços Adicionar 1 g de agarose (RPI, A20090-500) a 100 ml de água desionizada num frasco ml 250-500 e autoclave para esterilizar a agarose (121 ° C, 15 psi, 15 min, em uma máquina de autoclave). Transferir a garrafa com agarose esterilizado em um banho de água 70 ° C. A agarose está pronto para ser derramado quando é arrefecida a 70 ° C, o que demora cerca de uma hora. Certifique-se de manter o estéril agarose em todos os momentos. Obter os 24 poços de fundo plano (Falcon placas, 353,047); qualquer tipo de 24 poços de fundo plano Placas funcionaria se as placas podem ser visualizados sob um microscópio de contraste de fase. Dispense 200 ul de agarose a cada poço com uma pipeta Eppendorf repetidor em uma cabine de segurança biológica e agite a agarose em torno do bem para torná-lo cobrir o bem de forma uniforme. 200 ul de agarose é adequado para formar uma superfície côncava de modo a que esferóides podem formar as formas consistentes esféricas. Menos de 200 ul de agarose não podecobrir o bem inteiramente, mas mais do que 200 ul de agarose não pode formar a superfície côncava e os esferóides cultivadas em que não podem formar formas esféricas. A agarose revestidas placas de 24 poços estão prontos para ser utilizados em cerca de 10 min. (Opcional) Adicionar 100 ul de meio para equilibrar a agarose com meio de cultura antes de células de semeadura. Alternativamente, após a agarose é totalmente solidificados, adicionar 100 meio de crescimento uL a cada poço e selar as placas com a fita de vedação estéril (Nunc, 236,366). Estas placas podem ser armazenadas a 4 ° C durante até uma semana. 2. Preparação de suspensões de células únicas Todas as experiências são realizadas utilizando as técnicas padrão assépticas num armário de segurança biológica e todas as culturas são crescidas em um 37 ° C incubadora humidificada com 5% de CO 2 em ar, a menos que especificado. Pancreático humano NET Bon-1 células são mantidas em DMEM/F12 (Invitrogen, 10.565) com 10% de soro fetal bovino (FBS, Invitrogen,16000-044 médio) em uma de 100 mm x 20 mm prato de cultura estéril tecido (Corning, 430,167). Quando monocamada Bon-1 das células atingirem 70-80% de confluência, o meio é removido. As células são lavadas com PBS duas vezes, e desalojado do prato por adição de 1 ml TrypLE (Invitrogen, 12.604) com 5 minutos de incubação a 37 ° C. TrypLE é semelhante à tripsina, mas é estável a 15 – 30 ° C, bem como a 4 ° C. Confira ao microscópio para se certificar de todas as células são separadas do prato. Adicionar 9 ml de meio de crescimento das células tripsinizadas e usar uma pipeta para pipetar células para cima e para baixo algumas vezes para assegurar uma suspensão de células até único. Use 70-iM célula coador (Fisher, 22.363.548) para filtrar as células. Recolher células e realizar uma contagem de células utilizando goiaba PCA-96 Sistema de Base (Millipore). Preparar uma suspensão de 5.000 células por ml em fenol livre de DMEM/F12 com meio de crescimento 10% de FBS. 3. Cultura esferóide Overlay ul 200 do únicoAs suspensões de células para a agarose revestido placa de 24 poços e selar as placas de 24 poços com a fita de vedação estéril para evitar a evaporação. Nota: – O número de células a serem plaqueadas deve ser determinado empiricamente com base no tamanho dos esferóides no dia 6; 300-400 diâmetro iM dos esferóides seria o tamanho ideal para o início do tratamento com drogas; 1000 BON-1 e H727 células são semeadas. – Não é recomendável partida tratamentos com drogas após o dia 6, porque a viabilidade das células 3D começa a cair a cerca de 10 dias (dados não mostrados, manuscrito em preparação). Colocar os acima de agarose revestidas placas de 24 poços com BON-1 células sobre um agitador orbital a uma agitação muito lenta de menos de 40 rpm durante a noite num 37 ° C incubadora humidificada com 5% de CO 2 em ar. Em seguida, estas placas mover para uma plataforma estável para manter as culturas em crescimento. Adicionar 200 uL de meio de crescimento cada poço da placa acimas cada 3 dias. Não perturbe os esferóides. Tentar adicionar médio através da parede de cada poço, tocando a ponta da pipeta para o lado do poço, e deixando que o fluxo médio para baixo para dentro do poço. Monitorar a formação esferóide nas placas de 24 poços sob um microscópio. 4. Tratamento de Drogas Quando os esferóides atingir cerca de 300-400 um de diâmetro no dia 6, os esferóides 3D são tratados com a droga. Este é denotado como 0 dias de tratamento da toxicodependência. No dia 6, cada poço da placa contém cerca de 400 ul de meio. Para garantir que os tratamentos com drogas estão em concentração final 1x em cada poço, 3x diluições em série de cada dose de tratamentos são feitos a partir da reserva de fármaco em meio de crescimento 5 ml num tubo de 15 ml, o que é suficiente para 8 repetições. Os esferóides em cada linha da placa de 24 cavidades são categorizados como veículo, a dose de 1, 2, 3, 4 e 5. Existem quatro réplicas para cada dose de tratamentos em uma placa de 24 poços (ver <strong> Tabela 1). Nós geralmente tratar esferóides 3D pelo menos em 2 placas de 24 poços, que faz com que, pelo menos, 8 repetições para cada dose de tratamentos. Girar para baixo a placa de 24 poços a 800 rpm durante 5 min a 4 ° C para se certificar de que todas as condensações sobre a fita de vedação ir para dentro do poço. Devido à característica flutuante dos esferóides 3D, o meio em cada poço não é removido para evitar a perturbação dos esferóides. Adicionar cuidadosamente 200 ul dos tratamentos acima feita de cada dose nos poços apropriados ao longo da parede de cada poço. Selar as placas de 24 poços com a fita de vedação e incubar as culturas no 37 ° C incubadora humidificada com 5% de CO 2 em ar. Se necessário, recuar os esferóides em cada poço com a respectiva dose de tratamentos após 72-96 horas. 5. Monitor 3D Culturas esferóides Em cada ponto de tempo escolhido após tratamentos com drogas (0, 24, 48, 72 hr), os esferóides em cada poço de t24-ele bem placa são gravadas com um microscópio Zeiss Axiovert de contraste de fase 200/M-based usando uma objetiva de 5x. Nota: As imagens podem ser tomadas em qualquer microscópio de luz com uma escala calibrada entre mM e pixel. A objetiva de 5x, é ideal porque os esferóides rapidamente ultrapassar o campo de imagem com uma objetiva de 10x. Esferóide análise pode ser realizada manualmente, utilizando Zeiss AxioVision 4.8.2 Software com as imagens brutas. Alternativamente, um costume desenvolvido programa MATLAB é utilizado para estimar o tamanho dos esferóides automaticamente / semi-automática. O programa automático implementa o algoritmo contorno activo 4 para localizar com precisão o contorno do esferóide em uma determinada imagem e medir a sua maior (L) e menores (W) eixos automaticamente. Uma versão semi-automática do mesmo algoritmo permite que os usuários para ajudar a iniciar o programa quando artefato forte está presente. Todas as imagens precisam ser exportada como TIFF ou JPEG de formatos de arquivoNas imagens originais para serem lidos pelo programa. O volume do esferóide é estimada como 0,5 x L x W 2. 6. HistoGel incorporação dos esferóides-3D Net 10-24 esferóides são recolhidos a partir das placas de 24 poços, lavou-se duas vezes em PBS, fixadas em formalina a 10% durante 2 horas, lavou-se em 50% e etanol a 70% durante 15 min, duas vezes, respectivamente, e estão prontos para incorporação HistoGel. Alternativamente, eles podem ser mantidos em etanol a 70%, a 4 ° C durante vários meses. Um tubo de frio HistoGel (Thermo Scientific, HG-4000-012) é colocada num copo cheio com água. A proveta é aquecida num microondas durante 1 min ou até que o gel é completamente liquefeito, depois mantido no copo cheio de água mesma em todos os momentos. Os esferóides em etanol a 70% a partir de cima são transferidos para um cryomold biópsia (Tissue-Tek, Sakura Finetek, 4565) usando um palito de dentes. Certifique-se de todos os esferóides são transferidos. Deixe os esferóides sentar-se por um minuto a afundar para baixo para o fundo do biopsy cryomold. Tente se livrar dos líquidos no cryomold biópsia com Kimwipes e, entretanto, muito gentilmente empurrar os esferóides ao centro na parte inferior do cryomold biópsia usando o plástico descartável pipeta Pasteur. Este passo pode ser mais fácil de ser feita sob um microscópio de dissecação. Uma fina camada de HistoGel aquecido é adicionado à cryomold biópsia para estabilizar os esferóides, na parte inferior do cryomold biópsia; por sua vez, o palito é usado para manter os esferóides no centro, na parte inferior do cryomold biópsia muito suavemente. Não adicionar HistoGel muito, mas apenas o suficiente para estabilizar os esferóides, na parte inferior do cryomold biópsia. Deixe os esferóides / HistoGel sentar-se por 1-2 minutos à temperatura ambiente ou até que o HistoGel é solidificado. Em seguida, preencha o resto do cryomold biópsia com o HistoGel aquecido. Permitir que a solidificar à temperatura ambiente durante cerca de 10 min. Pouco antes de estalar os esferóides / bloco HistoGel do cryomold biópsia, leave-lo a 4 ° C durante 1 min, o que ajuda a estalar os esferóides intacta / bloco HistoGel. Os esferóides / bloco HistoGel é então envolto em um pedaço de Bio-wraps (Surgipath, 01090) e colocar em um tecido e cassete biópsia (Fisher Scientific, 15-182-701D). O tecido e cassete biópsia é armazenado num recipiente com etanol a 70%. Em seguida, os procedimentos de tecido de rotina de processamento de parafina são seguidos. 5 O bloco de parafina pode ser seccionado em 3-iM lâminas camada espessa. As lâminas podem ser corados com hematoxilina e eosina para determinar as alterações histológicas e também pode ser utilizado para a coloração imuno-histoquímica. 7. Os resultados representativos Pancreático humano linhas tumorais neuroendócrinos células BON-1 (fornecido a Verto Instituto por Kjell Oberg, Uppsala University, Suécia), QGP-1 (Japanese Health Sciences Foundation, Osaka, Japão), e neuroendócrino tumor de pulmão humano de células da linha H727 (ATCC) foram cultivados num agarose-revestido placa de 24 cavidades. Como visto na Figura 1, as três linhas de células mostram a morfologia diferente. Células BON-1 e H727 formado esferóides 3D. Sob o microscópio, as células apresentaram H727 esferóides mais apertados e mais compacto que o Bon-1 células. Nós supomos que a H727 células têm uma capacidade maior de adesão célula-célula e formam junções apertadas como resultado. QGP-1 células mostram grandes uva como massas porosas, que não são considerados esferóides. Devido ao interesse crescente de pesquisa pancreática tumor neuroendócrino nos últimos anos, BON-1 células são utilizadas para o resto das figuras. Após espalhar Bon-1 células na agarose revestido placa de 24 poços, a formação de esferóides multicelular ocorre tipicamente por º dia 3 rd ou 4 e os esferóides tornar-se mais redondo pelo dia 6 th. Devido à limitação de nutrientes e de oxigénio, as células do núcleo denso dos esferóides começam a morrer por volta do dia 10 e por dia 17, os esferóides começam a desintegrar-se, devido ao grande tamanho ou na formame os casos, a ejeção do núcleo necrótico. Os esferóides tipicamente pode crescer até 1.000 m de diâmetro. A Figura 2 mostra as secções da formação de crescimento, e desintegração do Bon-1 esferóides 3D. Os tratamentos medicamentosos foram iniciadas quando esferóides foram em torno de 300-400 mM e células retidas alta viabilidade (manuscrito em preparação). Dia 6 esferóides 3D foram escolhidos como ponto de partida para os tratamentos com medicamentos. Tem sido relatado que os inibidores da histona mostraram efeitos antiproliferativos e proapoptóticos sobre as células NET. 6 Nós escolhemos a histona-desacetilase inibidor Tricostatina-A 3A (TSA), como um exemplo para ilustrar o efeito do tratamento com drogas em 3D esferóides NET. Figura mostra a morfologia dos esferóides 3D sobre o tratamento de TSA Figura. 3B mostra o volume dos esferóides 3D sobre TSA (Sigma, T8552) de tratamento. O tamanho de cada indivíduo foi estimada esferóide automaticamente por um custom-desenvolvido MATLAB programa de computador. 4 Um passo de desenho manual foi adicionada para ajudar a obter os esferóides, que eram muito perto da extremidade de uma dada imagem. Pelo menos 8 esferóides foram medidos por dose de tratamentos de TSA em cada ponto de tempo. O volume de cada esferóide 3D ​​foi calculada como 0,5 x Comprimento x Largura 2. Como visto na Figura 3A e 3B, em relação ao veículo, todas as doses de TSA mostrados nas figuras demonstrado algum grau de inibição do crescimento de Bon-1 esferóides 3D. Entre eles, as concentrações de 125 nM e 250 nM de TSA fortemente reprimida o crescimento de esferóides 3D e levou à morte celular em 96-hr ponto de tempo. Para compreender a histologia dos esferóides NET 3D, um H e E e coloração (IHC) imuno-histoquímica foram realizados em esferóides 3D que tinha sido cultivadas durante 17 dias. Figura 4A ilustra um método para processar esferóides 3D para incorporação HistoGel, que é a chave passo para inclusão em parafina de 3D spher oids. A Figura 4B mostra a coloração HE, a coloração imuno-histoquímica da clivados caspase-3 (um marcador de células apoptóticas) e Ki-67 (um marcador para a proliferação de células) em anticorpos esferóides 3D, que tinha sido cultivadas durante 17 dias . As células no interior do núcleo dos esferóides 3D são na maior parte necrótica / apoptótico e as células da camada exterior são activamente a proliferar. Figura 1. A morfologia de NET Esferóides 3D. Os esferóides 3D a partir de três linhas de células humanas de tumor neuroendócrinos são formados em agarose revestidas placas de 24 poços. 1.000 células BON-1, H727 e QGP-1 foram semeados em agarose revestidas placas de 24 poços e cultivadas em uma condição fisiológica normal, conforme detalhado no protocolo. Estas são as imagens de esferóides 3D para BON-1 e H727 ou célula agregados para QGP-1, que foram cultivadas durante 10 dias. 18/4218fig2.jpg "alt =" Figura 2 "/> Figura 2. O Tracking Crescimento de BON-1 Esferóides 3D O rastreamento crescimento de esferóides Bon-3D: 1. Crescimento, formação e desintegração de esferóides 3D. Como detalhado no protocolo, 1,000 Bon-1 células são plaqueadas em um agarose revestido placa de 24 cavidades. As células são cultivadas num meio DMEM/F12 padrão com FBS a 10% sobre um agitador orbital em uma condição fisiológica durante a noite, em seguida, mudou-se sobre uma plataforma estável e cultivadas nas mesmas condições. O crescimento das células de rastreamento 3D foram seguidos por células de imagem a cada hora para o primeiro 5 horas após o plaqueamento, e depois a cada 1-3 dias com uma Axiovert Zeiss 200/M-based de contraste de fase utilizando um microscópio de objetiva de 5x. As células agregadas em massas em primeiro lugar, em seguida, formar agregados multicelulares, esferóides pequenos, esferóides maiores e, eventualmente, os esferóides se desintegram. Figura 3. TSA Tratamento de BON-1Esferóides 3D. (A) Imagens de esferóides 3D sobre tratamento TSA. Tratamento grupo: V – Veículo (0,0025% DMSO); D1 dose-1 (15,625 nM TSA); dose-D2 2 (31,25 nM TSA); D3: dose 3 (62,5 nM TSA); D4: dose de 4 (125 nM TSA ); D5: dose de 5 (250 nM TSA). Tempo de tratamento: 0 H – ponto de tempo que os tratamentos iniciados no dia 6 esferóides 3D; 24 h, 48 h, 72 he 96 e H são os pontos de tempo após os tratamentos iniciado. Esferóides 3D foram visualizados em cada ponto de tempo como antes. (B) Crescimento dos esferóides 3D após tratamento TSA. Os principais (L) e menores (W) eixos dos esferóides 3D em (A) foram estimados automaticamente pelo programa Matlab em cada ponto de tempo de tratamentos (0, 24, 48, 72 e 96 h). O volume dos esferóides 3D foi estimada como sendo 0,5 x L x W 2. O volume do esferóide no gráfico foi a média de 8 repetições e da barra de erro foi estimada com base na 8 repetições. Tabela 1.Disposição dos tratamentos com drogas sobre uma placa de 24 poços A Figura 4A. Ilustração de um método para processar Esferóides 3D para Embedding HistoGel. Um método para processar esferóides 3D para incorporação HistoGel e coloração imuno-histoquímica dos esferóides 3D (A) Uma visão geral de um método para processar esferóides 3D para a incorporação HistoGel. Esferóides 3D foram encapsuladas em um HistoGel de estar no mesmo nível no cryomold biópsia, em seguida, o HistoGel / bloco esferóides foi embrulhado num azul Bio-envoltórios e transferida para uma cassete de biópsia amarelo para inclusão em parafina. Figura 4B. H & E Coloração e coloração imuno-histoquímica do dia 17 Esferóides 3D. (B) coloração H & E, coloração imuno-histoquímica de Ki-67 e Clivadas Caspase-3 dos esferóides 17-dia em 3D. O paraffin-incorporados lâminas seccionados foram desparafinizados e recuperação antigênica foi realizada utilizando CCI (solução de células condicionado, Verana Medical System, # 711-065-152). Anticorpo policlonal de coelho Ki-67 de anticorpos (Abcam. # Ab833) e clivado Caspase 3 anticorpo (Cell Signaling Technology, # 9661) foram aplicados a uma concentração de 1:75 e 1:200, respectivamente, durante 1 h à temperatura ambiente. O anticorpo secundário anti-coelho (Jackson Immunolab, # 711-065-152) foi aplicado a 1:500 durante 1 hora à temperatura ambiente, seguido por detecção cromogénico kit DABMap (Ventana Medicai Systems, # 760-124). As lâminas foram contrastadas com hematoxilina e desidratados e limpo antes de lamínulas de xileno.