인간 Neuroendocrine 종양 치료의 연구를위한 3 차원 모델로 인간 Neuroendocrine 종양 세포 라인

1. 1퍼센트 아가로 오스 코팅 24 잘 플레이트의 작성 아가로 오스 멸균을 위해 250-500 ML 병을 및 압력솥 100 ML 탈이온수에 1g 아가로 오스 (RPI, A20090-500)을 추가 (121 ° C, 15 PSI, 압력솥 머신에서 15 분). 70 ° C의 물 목욕으로 소독 아가로 오스와 병을 전송합니다. 아가로 오스는 그것이 약 한 시간 걸립니다 70 ° C로 냉각하면 금방 부어받을 준비가되어 있습니다. 항상 아가로 오스 멸균을 유지하시기 바랍니다. 24 잘 평면 바닥 접시 (팔콘, 353,047)을 구하는, 접시는 위상 대비 현미경으로 몇 군데있다면 24도 평면 바닥 플레이트 모든 종류의 일을합니다. biosafety 캐비닛하고 잘 균일하게 커버하게 잘 주변에 소용돌이 아가로 오스를에서 Eppendorf 중계기를 피펫으로 각각 잘으로 아가로 오스 200 μl를 분배. 아가로 오스 200 μl가 spheroids는 일관된 구면 모양을 형성할 수 있도록 오목한 표면을 형성하는 것이 바람직하다. 미만 200 μl 아가로 오스하지 않을 수물론 전체를 커버하지만, 200 개 이상의 μl 아가로 오스는 오목한 표면 위에 성장 spheroids를 형성하지 않을 수 있습니다 구면 모양을 형성하지 않을 수 있습니다. 아가로 오스 – 코팅된 24-잘 번호판은 약 10 분에서 사용할 준비가 된 것입니다. (선택 사항) 이전 시딩 세포에 배지와 아가로 오스를 평형하는 매체의 100 μl를 추가합니다. 또는 아가로 오스가 완전히 경화 후, 각도에 100 μl 성장 매체를 추가하고 멸균 씰링 테이프 (Nunc, 236,366)로 번호판을 봉인. 이 번호판은 최대 1 주일 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 2. 단일 세포 현탁액의 준비 모든 실험은 biosafety 캐비닛에 표준 무균 기술을 사용하여 수행되며 명시하지 않는 한 모든 문화는 공기의 5 % CO 2와 37 ° C humidified 인큐베이터 재배하고 있습니다. 인간의 췌장 NET 봉-1 세포 10% 태아 소 혈청 (FBS, Invitrogen과 DMEM/F12 (Invitrogen, 10565)에 보관됩니다100mm에서 16000-044) 중간 X 20mm 무균 조직 배양 접시 (코닝, 430,167). 단일층 봉-1 세포가 70~80%가 confluency 도달하면 매체가 제거됩니다. 세포는 37시 5 분 인큐베이션 1 개 ML TrypLE (Invitrogen, 12604)을 추가 ° C를하여 두 번 PBS로 씻어, 그리고 요리에서 dislodged됩니다 TrypLE는 트립신과 비슷하지만, 15 안정적입니다 – 30 ° C뿐만 아니라 4에 ° C. 모든 세포는 접시에서 분리되었는지 확인하기 위해 현미경으로 확인합니다. trypsinized 전지 9 ML 성장 매체를 추가하고 심지어는 단일 세포 현탁액을 보장하기 위해 몇 번 아래로 조직을 피펫하고 피펫을 사용합니다. 세포를 필터링하기 위해 70 μm의 세포 스트레이너 (피셔, 22363548)를 사용합니다. 세포를 수집하여 구아바 PCA-96베이스 시스템 (Millipore)를 사용하여 셀 카운트를 수행합니다. 10% FBS 성장 매체와 페놀없는 DMEM/F12에 ML 5,000 세포 현탁액을 준비합니다. 3. 회전 타원체 문화 싱글의 중첩 200 μl셀 아가로 오스 코팅 24 잘 판에 현탁액과 증발을 방지하기 위해 멸균 씰링 테이프로 24 잘 번호판을 봉인. 참고 : – 도금되는 세포의 숫자는 하루에 6 spheroids의 크기에 따라 경험적으로 결정되어야하며 spheroids의 300-400 μm의 직경은 약물 치료를 시작하기위한 이상적인 크기는 될 겁니다; 1000 봉-1과 H727 세포 도금있다. – 3D 세포의 생존 능력에 대해 10 일째 (데이터 준비 원고, 보이지 않음)에 떨어지기 시작하기 때문에 우리는 6 일 후에 약물 치료를 시작하지 않는 것이 좋습니다. 공중에 5 % CO 2와 37 ° C humidified 인큐베이터에서 하룻밤 미만 40 RPM의 매우 느린 교반시 궤도 흔드는에 많이-1 세포와 위 아가로 오스 코팅 24 잘 접시를 놓습니다. 그런 문화가 성장을 유지하기 위해 안정적인 플랫폼으로 이러한 번호판을 이동합니다. 상기 플레이트의 각도 200 μl 성장 매체를 추가하십시오의 삼일마다. spheroids 방해하지 마십시오. 잘 사이드로 피펫 팁을 만진하고 잘으로 매체 흐름을 실망시키는하여 각 우물의 벽을 통해 매체를 추가해보십시오. 현미경으로 24 잘 접시의 회전 타원체 형성을 모니터링합니다. 4. 약물 치료 spheroids 하루 6 직경 300-400 μm의 주위에 도달하면 3D spheroids 마약으로 취급됩니다. 이것은 약물 치료에 대한 당일 0으로 표시된됩니다. 일 6, 접시의 각 우물은 매체의 주위에 400 μl가 포함되어 있습니다. 8시 정도 복제는 15 ML 원뿔 튜브, 5 ML 성장 매체에 제약 주식에서 만들어진 약물 치료는 치료의 각 복용량의 각도, 3 배 시리얼 dilutions의 1X 최종 농도에 있는지 확인합니다. 24 잘 플레이트의 각 행에에 spheroids는 자동차, 투여량 1, 2, 3, 4와 5로 분류됩니다. 4 (보고 한 24도 접시에 트리 트먼트의 각 복용량에 대한 복제가 있습니다 <stroNG> 표 1). 우리는 보통 적어도 최소한 8을 만들어이 치료의 각 복용량에 대해 복제이 24도 접시에 3D spheroids 취급. 4에서 5 분, 800 rpm으로 24도 플레이트를 던가 ° 씰링 테이프에있는 모든 condensations가 잘 들어갈 있는지 확인하기 위해 C #. 3D spheroids의 부동 기능으로 인해 각 음의 매체는 spheroids의 교란을 피하기 위해 제거되지 않습니다. 조심스럽게 각 우물의 벽을 따라 적절한 우물에 각 복용량의 위에 만들어진 트리 트먼트 200 μl를 추가합니다. 씰링 테이프로 24 잘 번호판을 밀봉하고 37 년에 문화를 품어 ° C 공기에 5 % CO와 humidified 보육 2. 필요한 경우 72-96 시간 이후에 치료의 각 복용량과 각도에 spheroids를 후퇴했습니다. 5. 모니터 3D 회전 타원체의 문화 t의 각도에 약물 치료 후 각각 선정 시점 (0, 24, 48, 72 HR)에서, spheroids그는 24 잘 플레이트는 5 배 목표를 사용하여 자이스 혈구 Axiovert 200/M-based 위상 대비 현미경으로 몇 군데있다. 참고 : 이미지가 μm의 및 픽셀 사이의 보정 스케일링과 함께하는 가벼운 현미경으로 촬영하실 수 있습니다. spheroids 빠르게 10X 목적으로 이미징 필드를 자라다 때문에 5 배 목표는 이상적입니다. 회전 타원체 분석 원시 이미지로 자이스 혈구 AxioVision 4.8.2 소프트웨어를 사용하여 수동으로 수행할 수 있습니다. 또는 사용자 정의 개발된 MATLAB 프로그램은 자동 / 세미 자동으로 spheroids의 크기를 추정하는 데 사용됩니다. 자동 프로그램은 정확하게 주어진 이미지 회전 타원체의 윤곽을 찾아 자동으로 주요 (L)과 부 (W) 도끼를 측정하기위한 적극적인 윤곽 알고리즘 4 구현합니다. 동일한 알고리즘의 반자동 버전은 사용자가 강력한 유물이 존재하는 경우 프로그램을 시작하는 데 도움이 있습니다. 모든 이미지의 TIFF 또는 JPEG 파일 형식으로 내보낼해야프로그램에서 읽을 수있는 RAW 이미지. 회전 타원체의 부피는 0.5 X 패 X 승 2로 추정된다. 6. NET 3D Spheroids의 HistoGel-퍼가기 10-24 spheroids은 2 시간을위한 포르말린 10 % 해결, 두 번 PBS로 씻어, 24 잘 접시에서 수집한 50 % 씻어 15 분 70 % 에탄올 두 번 각각, 그리고 HistoGel의 삽입을위한 준비가되어 있습니다. 양자 택일로, 그들은 몇 달 동안 4 ° C에서 70 % 에탄올에 보관하실 수 있습니다. 추운 HistoGel (써모 과학, HG-4000-012)의 튜브를 물로 채워진 비커에 들어가게된다. 비커는 1 분 전자 레인지에 가열하거나 겔이 완전히 다 녹아 버렸어요 때까지 다음, 항상 같은 물이 채워진 비커에 보관됩니다. 위에서 70 % 에탄올에 spheroids은 이쑤시개를 사용하여 생검 cryomold (조직 – 테크, 사쿠라 Finetek, 4565)로 전송됩니다. 모든 spheroids 전송하고 있는지 확인하십시오. spheroids은 바이오 아래로 가라 앉 히 잠시 앉아서PSY는 cryomold. Kimwipes와 생검 cryomold에있는 액체를 제거하고 한편 매우 부드럽게 일회용 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 생검 cryomold 하단의 중앙에 spheroids 밀어 봅니다. 이 단계는 해부 현미경으로해야 할 일이 쉬울 수도 있습니다. 예열 HistoGel의 박막 층을 생검 cryomold 하단의 spheroids를 안정화하기 위해 생검 cryomold에 추가됩니다; 한편, 이쑤시개 매우 부드럽게 생검 cryomold 하단의 중앙에 spheroids을 유지하는 데 사용됩니다. 생검 cryomold 하단에 spheroids 안정화를 위해 충분 너무 HistoGel를 추가하지만,하지 마십시오. spheroids / HistoGel는 상온에서 혹은 HistoGel가 경화되어 때까지 1-2 분 동안 앉아 보자. 그런 다음 예열 HistoGel와 생검 cryomold의 나머지 부분을 채운다. 그것이 약 10 분 동안 상온에서 응고하도록 허용합니다. 직전 생검 cryomold, 숨기려에서 spheroids / HistoGel 블록을 보여주고로그대로 spheroids / HistoGel 블록 터지는 도움 1 분, 대해 4 ° C에서이 있어요. spheroids / HistoGel 블록 후 바이오 랩의 조각 (Surgipath, 01090)에 포장해서 조직 및 생검 카세트 (피셔 과학, 15-182-701D)에 투입된다. 조직 및 생검 카세트는 70 %의 에탄올과 컨테이너에 저장됩니다. 그런 다음 파라핀에 삽입을위한 일상적인 조직 처리 절차는 다음에있다. 5 파라핀 블록은 3 μm의 두께 계층 슬라이드로 sectioned 될 수 있습니다. 슬라이드는 histological 변경 사항을 결정하기 위해 hematoxylin과 eosin 물들일 수 있으며 immunohistochemical 염색법에 사용할 수 있습니다. 7. 대표 결과 인간의 췌장 neuroendocrine 종양 세포 라인 봉-1 (Kjell Oberg, 웁살라 대학, 스웨덴에 의해 Verto 연구소 제공), QGP-1 (일본어 보건 과학 재단, 오사카, 일본), 그리고 인간의 폐 neuroendocrine 종양 세포 라인 H727은 (ATCC)했다 agaros에 성장전자 코팅 24 잘 판. 그림 1에 보이는 것처럼, 세 개의 셀 라인은 서로 다른 형태로 표시됩니다. 봉-1과 H727 세포는 3D spheroids을 형성했다. 현미경, H727 세포가 많이-1 세포 친밀해 더 컴팩트 spheroids을 보여주었다. 우리는 H727 세포가 세포 – 세포 부착을위한 증가된 용량을 가지고 있고 결과로 꽉 분기점을 형성한다는 가설. QGP-1 세포가 spheroids으로 간주되지 않는 대형 포도와 같은 다공성 대중을 보여줍니다. 최근 췌장 neuroendocrine 종양 연구의 상승 관심 때문에 많이-1 세포 숫자의 나머지를 위해 사용됩니다. 아가로 오스 코팅 24 – 잘 접시 봉-1 세포를 퍼뜨리고 후, 다세포 spheroids 형성은 일반적으로 3 회 또는 4 회 하루에 의해 발생 spheroids는 6 일 당일에 의한 라운드 게임이된다. 양분과 산소의 제한으로 인해 spheroids의 치밀한 코어의 세포가 하루 10 시쯤에 그리고 그날 17 일까지 죽기를 시작 spheroids 인해 큰 규모 정도의를 분해하기 시작나에게 사건 괴사성 코어의 방출을. spheroids는 일반적으로 직경이 1,000 μm의 최대 성장할 수 있습니다. 그림 2 봉-1 3D spheroids의 형성, 성장과 붕괴의 섹션을 보여줍니다. spheroids가 300-400 μm의 주위와 세포가 높은 생존을 (준비 원고) 보관있을 때 약물 치료가 시작되었다. 6 일 3D spheroids는 약물 치료를위한 시작 지점으로 선정되었다. 그것은 히스톤 deacetylase 억제제는 NET 세포에 antiproliferative 및 proapoptotic 효과를 보여준 것으로보고되었습니다. 6 우리는 (TSA) 3D NET spheroids에 대한 약물 치료의 효과를 설명하기 위해 예를 들어 있습니다. 그림 3A가 보여주는 히스톤-deacetylase 억제제-Trichostatin 선택 TSA. 그림 3B의 치료시 3D spheroids의 형태 TSA (시그마, T8552) 치료시 3D spheroids의 볼륨을 보여줍니다. 각각 회전 타원체의 크기는 cus에 의해 자동으로 추산되었다MATLAB 컴퓨터 프로그램을 탐 – 개발 4. 수동 그리기 단계가 주어진 이미지에 가까운 가장자리에 있었다 spheroids을 취득할 수 있도록 추가되었습니다. 최소한 8 spheroids는 각 시점에서 TSA 치료의 선량에 따라 측정되었다. 각 3D 회전 타원체의 부피는 0.5 X 길이 X 폭 2로 계산되었다. 마찬가지로 차량에 대한 상대 그림 3A 및 3B에서 볼 수있는 그림에 표시된 TSA의 복용은 많이-1 3D spheroids의 성장 억제 어느 정도 보여주었다. 그중 125 nm의 및 TSA 250 NM의 농도가 가장 강력하게 3D spheroids의 성장을 억압하고 96 시간의 시점에서 세포 죽음으로 이끌었습니다. NET 3D spheroids의 조직학을 이해하기 위해서는 H & E와 immunohistochemical (IHC) 염색법 17 일간 배양해되었던 3D spheroids에서 수행되었다. 그림 4A가 중요있는 HistoGel 삽입을위한 3D spheroids을 처리하는 방법을 보여줍니다 3D spher의 파라핀의 삽입을위한 단계 oids. 그림 4B는 H & E 염색법, 죽습 caspase-3 (apoptotic 세포에 대한 표지)와 KI-67 immunohistochemical 염색법 (세포 proliferating위한 마커) 3D spheroids에 대한 항체, 17 일 동안 배양해되었습니다 보여줍니다 . 3D spheroids의 핵심 내의 세포가 대부분 괴사성 / apoptotic이며 외부 레이어 세포 적극적 proliferating 있습니다. 1 그림. NET 3D Spheroids의 형태론. 세 인간 neuroendocrine 종양 세포 라인에서 3D spheroids는 아가로 오스 코팅 24 – 잘 접시에 형성된다. 1000 봉-1, H727 및 QGP-1 세포는 아가로 오스 코팅 24 – 잘 접시에 놓는 및 프로토콜에 대한 상세한으로 정상 생리 상태로 성장했다. 이들은 10 일 동안 배양해되었다 QGP-1 봉-1과 H727 또는 셀 집계를위한 3D spheroids의 이미지입니다. 18/4218fig2.jpg "고도 ="그림 2 "/> 그림 2. 봉-1 3D Spheroids의 성장 현황 봉-1 차원 spheroids의 성장 추적 :. 형성, 성장 및 3D spheroids의 붕괴. 프로토콜에 설명된 바와 같이, 1000 봉-1 세포는 아가로 오스 코팅 24도 강판에 도금하고 있습니다. 세포가 하룻밤 생리적 상태 궤도 흔드는 10 % FBS와 표준 DMEM/F12 매체 재배 후 안정적인 플랫폼을 이동하고 동일한 조건으로 재배. 3D 세포 추적 성장은 도금 후 처음 5 시간 동안 이미징 세포 매 시간마다 다음 다음 자이스 혈구 Axiovert있는 모든 1-3일는 5 배 목표를 사용하여 위상 콘트라스트 현미경 200/M-based되었다. 첫번째 대중으로 집계 세포는 다음 다세포 집계, 작은 spheroids, 크고 spheroids, 결국 spheroids, 부스러질를 형성하고 있습니다. 그림 3. 봉-1에 대한 TSA 트리 트먼트3D Spheroids. () TSA 처리시 3D spheroids의 이미지. 치료 그룹 : V – 차량 (0.0025 % DMSO), D1-복용량 1 (15.625 NM TSA), D2-선량 2 (31.25 NM TSA); D3 : 투약 3 (62.5 NM TSA); D4 : 약을 사 (125 nm의 TSA ); D5 : 복용량 5 (250 nm의 TSA). 치료 시간 : 0 H – 시점 6 일 3D spheroids에서 시작 치료하는, 치료 시작 후 24 H, 48 H 72 H와 96 H가 시간이 포인트입니다. 3D spheroids는 각 시점 이전과에서 몇 군데 있었다. TSA 처리시 3D spheroids의 (B) 성장. ()의 3D spheroids의 주요 (L)과 부 (W) 도끼는 트리 트먼트의 각 시점 (0, 24, 48, 72 및 96 시간)에서 Matlab 프로그램에 의해 자동으로 추산되었다. 3D spheroids의 볼륨은 0.5 X 패 X 승 2로 추정되었다. 그래프의 회전 타원체의 부피는 8의 평균은 복제 였고 오류 막대는 8 개의 복제에 기반을 계산했다. 표 1.24 잘 접시 약물 치료의 레이아웃 그림 4A. HistoGel 임베딩위한 3D Spheroids을 처리하는 방법 삽화. HistoGel 삽입과 3D spheroids () HistoGel 삽입을위한 3D spheroids을 처리하는 방법의 개요 immunohistochemical 염색법을위한 3D spheroids을 처리하는 방식입니다. 3D spheroids는 생검 cryomold에서 같은 수준의 다음 HistoGel / spheroids 블록이 바이오 – 랩 파란색으로 포장해서 파라핀의 삽입을위한 노란색 생검 카세트 안으로 옮겨졌 다 참석해야 HistoGel에 캡슐되었다. 그림 4B. H & E 염색법과 요일-17 3D Spheroids의 Immunohistochemical 염색법. (B) H & E 염색법, Immunohistochemical KI-67 염색법과 17 일 3D spheroids 중 죽습 Caspase-3. Paraffin – 임베디드 sectioned 슬라이드 deparaffinized 있었고, 항원 검색은 CCI를 (셀 컨디셔닝 솔루션, Verana 의료 시스템, # 711-065-152)를 사용하여 수행되었다. 토끼 polyclonal KI-67 항체 (Abcam. # Ab833)은 죽습 Caspase 3 항체 (셀 시그널링 기술, # 9661)는 상온에서 1 시간 동안 각각 1:75과 1:200의 농도에 적용되었다. 안티 토끼 이차 항체가 (잭슨 Immunolab, # 711-065-152) chromogenic 탐지 키트 DABMap (Ventana 의료 장비, # 760-124)에 의해 다음, 실온에서 1 시간 동안 1:500에서 적용되었다. 슬라이드는 Hematoxylin과 탈수로 counterstained 및 크실렌에서 coverslipping 전에 지워집니다.