Поколения, очистки и клеточной вторжения внутриклеточных, цитоплазматические полную длину DISC1 белка aggresomes из клеточных культур и помечены, мультимерные рекомбинантного DISC1 фрагмент белка в<em> E. палочки</em> Описаны. Сотовые инвазивности показано для клеток реципиента в культуре клеток и нейронов<em> В естественных условиях</em> После стереотаксической прививки мозга.
Агрегации белков рассматривается как общий признак хронических дегенеративных заболеваний мозга, как, например, в нейродегенеративных заболеваний, болезни Альцгеймера (Ар, тау), болезнь Паркинсона (α-синуклеина), болезнь Хантингтона (полиглутаминовых, гентингтина), и другие. Агрегации белков, как полагают, происходят из-за нарушения proteostasis, то есть дисбаланс между возникновением и деградации неправильно свернутых белков. Следует отметить, что те же белки находятся собраны в спорадическими формами этих заболеваний, которые мутанта в редких вариантах семейных формах.
Шизофрения является хроническим прогрессирующим состояние мозга, что во многих случаях идет вместе с постоянными и необратимыми когнитивного дефицита. В подходе гена кандидата, мы исследовали, может ли Нарушенные-в-шизофрения 1 (DISC1), ген, клонированный в шотландской семьи с привязкой к хроническим психическим заболеванием 1, 2, может быть найдено в виде нерастворимых агрегатов в Braiп спорадических случаев шизофрении 3. Использование CC SMRI, мы определили примерно в 20% случаев с CMD, но не нормальное управление или пациентов с нейродегенеративных заболеваний sarkosyl нерастворимые DISC1 иммунореактивности после биохимического фракционирования. Последующие исследования в пробирке показали, что агрегация склонность DISC1 под влиянием болезни связанные полиморфизма S704C 4, и что DISC1 aggresomes генерируется в пробирке клетки были инвазивные 5, подобное тому, что было показано для Ар 6, тау 7-9, α -синуклеина 10, полиглутаминовых 11, или SOD1 агрегатов 12. Эти результаты побудили нас предположить, что по крайней мере подмножество случаев с CMD, те, с общей DISC1 может быть белка конформационные нарушения.
Здесь мы расскажем, как мы генерируем DISC1 aggresomes в клетках млекопитающих, очистить их от градиента сахарозы и использовать их для клеточной инвазии StudiES. Кроме того, мы расскажем, как мы создаем исключительно мультимерные С-концевой фрагмент DISC1, этикетки и очистить его для исследования клетки инвазивности. Использование рекомбинантных мультимеры DISC1 мы достичь аналогичных инвазивности клетки, как и для аналогичной надписью синтетических α-синуклеина фрагмент. Мы также показываем, что этот фрагмент взят в естественных условиях, когда стереотаксически вводили в мозг получателя животных.
В этой работе мы описываем очистки mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes из трансфицированных линии клеток нейробластомы, подготовка и маркировки рекомбинантного белка DISC1 видов и их применение в клеточной вторжения экспериментов клетки реципиента в пробирке и в естественных условиях.
Очистка родной mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes была разработана с протоколами, чтобы изолировать тело Леви-структур и крупных агрегатов 13, 14, но изменен, чтобы избежать использования моющих средств и минимизировать риск ложных положительных клеток вторжения, которые могут возникнуть в связи с моющим средством при содействии проницаемости мембран.
Одним из возможных улучшение будущем может быть, чтобы еще больше повысить чистоту aggresomes с помощью ультразвука полностью отделить оставшиеся мембраны и цитоскелета от aggresomes. При увеличении общей чистоты, общее количество событий вторжения, зафиксированного на большой aggresomes маУ быть увеличена 5. Если ограниченное определение из предложенных 3-фазный сахарозы является достаточным для aggresomes других видов белка должна быть проверена, в этом смысле протокол изложенные здесь следует рассматривать в качестве отправной точки для индивидуальной оптимизации. Очищенный aggresomes оказались весьма надежными в наших руках, дополнительные шаги стирки (без моющих средств), чтобы устранить следы сахарозы не значительно уменьшить общий выход.
В предыдущей публикации мы рассказали, что олигомер сборки DISC1 зависит от различных областей мультимеризацию в С-концом 4 (рис. 4). Мы выбрали этот фрагмент для рекомбинантного растворимого выражение в E. палочки и последующих и Ni-NTA очистки. Чтобы следить за его мультимеризацию и сравнить его клетки инвазивность с описанным клеточного белка, как инвазивные α-синуклеина, мы обозначили DISC1 (598-785) с флуоресцентным красителем DyLight594, и сравнил ееклеточных инвазивность с одинаково помечены α-синуклеина. Клеточных инвазивности рекомбинантного DISC1 фрагмент резко возросло по сравнению с родным, полная длина DISC1 aggresomes, вероятно, из-за меньшего размера и намного выше чистота. Опять же, чистота, кажется, играет решающую роль в клеточной инвазии.
В нашем примере инвазивных aggresomes работу растворимого белка гомолог линии клеток-мишеней, который был рекомбинантно выражается в растворимые, то есть клетки-дисперсной форме. Выражение флуоресцентного белка (GFP например, или RFP) в клеточной линии получателем является преимуществом, так как позволяет колокализации инвазивных aggresomes и рекомбинантных белков в пределах клетки получателя с помощью Z-стек изображений.
Cell-инвазивной DISC1 aggresomes и многомерные фрагменты выразил и очищают от E. палочка может стать определяющей чертой белка конформационного заболевания, связанные с DISC1, DISC1opathies 15.
Поиск и устранение неисправностей:
Температура aggresome выход после очистки сахарозы градиент:
Градиента сахарозы введена в данный протокол хорошо работает с eGFP/mRFP-DISC1 (Флорида) aggresomes. Aggresomes, состоящие из других белков может быть переменных размеров, следовательно, концентрации сахарозы должна быть оптимизирована за счет других пользователей.
Вашем очистки рекомбинантных белков:
Любой бактериальных загрязнений в процессе очистки рекомбинантного белка также будут помечены в последующих шагов протокола. Чтобы избежать загрязнений, запустить белка на SDS-PAGE и убедитесь, что рекомбинантного белка не менее 95% чистой окрашиванием Кумасси-Blue. Для обеспечения высокого качества и урожайности, протокол должен быть оптимизированы для каждого индивидуального белка.
Температура маркировке EFтивность рекомбинантных белков:
Любые загрязнения, которые содержат бесплатные SH-групп снизит эффективную маркировку белка. Таким образом, обширная диализа и Ni-NTA основе очистки является обязательным.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа финансировалась Нейрон-Eranet обнаружить (BMBF 01EW1003) в СК и JPH, DFG (Ko 1679/3-1; GRK1033), чтобы CKVB поддерживается грантом Forschungskommission медицинского факультета Университета Дюссельдорфа.
Reagent name | Company | Catalog number | Yorumlar | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | Medium is dependent on the host cell line. The optimal recipient cell line should be determined by the user. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DMEM/F-12 | Invitrogen | 11320-033 | Medium is dependent on the recipient cell line. The optimal recipient cell line should be determined by the user. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
PBS | Invitrogen | 14190-250 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Metafectene | Biontex | T020-1.0 | Other transfection reagents might work as well but were not tested with our protocol. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | The experiments were done with Ni_NTA agarose from Qiagen, other suppliers should work as well. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DNase I | Roche | 04716728001 | There is no need for RNase free DNase in the process of aggresomes purification. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Opti-MEM | Invitrogen | 31985-062 | Serum-free medium works as well | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | Supplement for SH-SY5Y and NLF medium | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Non-essential-amino-acids (NEAA) | Sigma-Aldrich | M7145 | Supplement for SH-SY5Y medium | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Trypan Blue 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154 | Toxic reagent | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DyLight 594 Maleimide | Thermo-Fisher Scientific | 46608 | Reduced cysteine reactive dye to form stable thioether bonds. Also available in other colors. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ProLong Gold with DAPI | Invitrogen | P36935 | This antifade liquid mountant gave superior results in our hands. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Protease Inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | Dissolve 1 table in 500 μl H2O for 100X solution. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Synthetic a-synuclein | Sigma | S7820 | Refold as described in text. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table of specific reagents. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Precellys 24 | Bertin Technologies | 03119.200.RD000 | We have not tested other mechanical homogenizers other than this. Other detergent free homogenization method might work as well, but have not been tested for this protocol. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
5301 Concentrator (speedvac) | Eppendorf | 5301 000.210 | Only necessary if protein has to be concentrated. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
LSM 510 and Axiovision Apotome2 | Zeiss | See manufacturers catalog | Both microscopes harbor the ability to perform Z-stack imaging. This is a prerequisite for solid and serious evaluation of invasion events. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Cell culture plastic material | Nunc | 10 cm dishes #172958, 24-well plates #142475 | The use of different plastic material might influence the interaction of recombinant proteins or aggresomes and the plastic surfaces. We have not tested materials other than the ones described here. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table of specific material and equipment. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|