Generazione, purificazione e caratterizzazione di specie DISC1 Cell-invasive Protein

1. Preparazione di cellule del donatore aggresome: trasfezione di monomerico proteina fluorescente rossa (MRFP) o Enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP)-tagged Figura umana intera (FL) DISC1 Seed 1,5 x 10 6/10 cm parabola umana neuroblastoma NLF (FLN; Children Hospital di Philadelphia, Philadelphia, PA), le cellule in dieci 10 piatti cm e crescere durante la notte. NLF cellule vengono coltivate in mezzo RPMI-1640 integrato con 10% FBS, penicillina / Strepomycin, L-glutammina. Il giorno successivo, le cellule devono essere al 70-80% di confluenza. Transitoriamente transfettare ogni piatto 10 cm con 15 pg di DNA plasmidico e reagenti di trasfezione Metafectene (Biontex, Martinsried, Germania). In breve, per un piatto 10 cm, 15 pg di DNA plasmidico e 30 Metafectene microlitri sono stati aggiunti a 750 pl Opti-MEM, miscelate e incubate a temperatura ambiente per 20 min. 5 piatti sono state trasfettate con pcDNA3.1 MRFP / eGFP-tagged umane (FL) DISC1 e 5 piatti con il eGFP-plasmide solo. 2. AggresomePurificazione di cellule del donatore trasfettate Il protocollo qui descritto è una combinazione di un metodo per purificare Lewy-Body da tessuto cerebrale 13 e un protocollo per isolare grandi aggregati e aggresomes 14. Poiché i metodi già esistenti sono basati sull'uso di detergenti, l'isolamento di detersivo privo di proteine ​​per l'applicazione in cella-invasività saggi è critica. 48 ore dopo la trasfezione, monitorare l'espressione di eGFP e mRFP/eGFP-DISC1 e confermare la formazione del aggresomes sotto un microscopio a fluorescenza (Figura 1). Lavare le cellule con PBS pH 7.4, raschiare con 400 microlitri di PBS ciascuna, aggiungere 1X cocktail di inibitori delle proteasi (Roche, Indianapolis, IN) e distruggere le cellule utilizzando un omogeneizzatore Precellys24 (tecnologie di Bertin, Francia). In breve, aggiungere 1 ml di sospensione cellulare in una provetta di lisi 2 ml e aggiungere 10 perle di ceramica. Lisare le cellule con 3 x 60 impulsi al secondo. La forza meccanica del processo puòaumentare la temperatura all'interno del campione superiore a 37 ° C quindi occorre prestare attenzione per raffreddare il campione nel ghiaccio dopo la procedura di lisi. Raffreddare le celle su ghiaccio e aggiungere 10 mM MgCl 2, 40 U / ml DNasi A e incubare per 60 min a 37 ° C Preparare soluzioni di 80%, 50%, 20% saccarosio (w / v) in PBS pH 7,4 (10 ml ciascuna). Preparare il gradiente di saccarosio in una provetta da 15 ml falcon, partendo con 2 ml di saccarosio 80%, seguito da 50% e 20%. Versare il gradiente lentamente e fare attenzione a non disturbare i livelli già versato. Strato il lisato digerito sopra il gradiente e centrifugare per 15 min a 1000 xga 4 ° C. Raccogliere accuratamente l'interfase tra lo strato di saccarosio del 50-80% con una pipetta e mescolare con 5 volumi di PBS pH 7,4. Centrifugare per 15 min a 1000 xga 4 ° C. Ripetere il lavaggio altre due volte. In questa interfase, aggresomes sono fluorescenti e possono essere visualizzati in un microscopio a luce UV. Eliminare il supernatante erisospendere il pellet in 250-500 microlitri di PBS pH 7.4. Questo pellet contiene il aggresomes purificata (Figura 2). 3. Trattamento dei destinatari cellule SH-SY5Y con mRFP/eGFP-DISC1 Aggresomes Sementi 5 x 10 4 destinatario SH-SY5Y neuroblastoma umano esprimono costitutivamente GFP-DISC1 (598-854) su vetrini sterili in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. SH-SY5Y cellule sono coltivate in DMEM/F-12 terreno supplementato con penicillina / streptomicina, aminoacidi non essenziali (NEAA) e 10% di FBS. 24 ore più tardi, aggiungere 10 microlitri in ciascun pozzetto e incubare per 48-72 ore. Lavare le cellule 3 x con PBS pH 7.4 e spegnere fluorescenza extracellulare con 0,04% Trypan Blue per 5 min. Fissare le cellule con 4% PFA in PBS pH 7.4 per 10 min in ghiaccio, lavare una volta con sterile H 2 O e montare i coprioggetti su vetrini con prolungare oro con DAPI montaggio medio (Invitrogen, USA). Confermare l'assorbimento /invasione di esogenamente aggresomes applicati dalla colocalizzazione con proteine ​​assunti espresse da cellule riceventi in Z-stack immagini. Eppure, assorbimento / invasione proteina esogena non potrebbe essere rilevata sostanzialmente in parallelo con l'assunzione di proteine ​​della cellula ospite. Nel nostro esempio MRFP-tagged DISC1 aggresomes recluta solubile GFP-tagged DISC1 (598-854) proteina espressa dalla cellula ospite (vedi Figura 3). Foto sono state scattate in un confocale Zeiss LSM 510 o di un microscopio Zeiss AxioVision Apotome2. 4. Generazione di DISC1 ricombinante (598-785) In una pubblicazione precedente abbiamo analizzato la capacità di vari DISC1 frammenti proteici di auto-interazione basata sulla presenza di auto-associazione domini. Tra tutte le proteine ​​frammenta testato DISC1 umano (598-785) visualizzata la forte propensione multimerizzazione 4 (Figura 4). Pertanto, DISC1 umano (598-785) è stato clonato in pET15b (nvagen, Madison, Wisconsin) contenente un 6-istidina N-terminale, espressa in E. coli BL21-(lDE3) Rosetta (Novagen, USA), e purificato in condizioni denaturanti a 8 mol / l urea come descritto 4. In breve, il protocollo è descritto di seguito. BL21-(IDE3) Rosetta E. coli sono state coltivate in 2 x 500 ml 2YT contenente 5 mM-arginina-HCl, 5 mM MgSO4, 100 pg / ml carbencillin, 35 mg / ml di cloramfenicolo fino ad una OD 600: 0,6-0,8 e DISC1 (598-785) è stata indotta l'espressione con 1 mM IPTG. DISC1 (598-785) è stata espressa per 4 ore a 37 ° C, l'espressione è stata terminata per raccogliere i batteri mediante centrifugazione. Il pellet batterico è stato risospeso in 50 ml di tampone TE (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 5 mM EDTA) più 2 mM PMSF, 1% TX-100, 250 ug / ml lisozima, 20 mM MgCl 2 e 400 ml U/50 DNasi I. Per garantire la completa lisi, la reazione è stata incubata per 30 min a temperatura ambiente con delicata agitazione. Aggiungere 10 mM β-mercaptoethanol (ME) e 500 mM NaCl e incubare per altri 30 min. Spin down corpi di inclusione batterici a 20,000 g per 30 min a 4 ° C. Risospendere il pellet in 50 ml di tampone di estrazione contenente 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM di imidazolo, 500 mM NaCl, urea 8 M e 10 mM β-ME e rimuovere detriti mediante centrifugazione a 20,000 g per 30 min a 4 ° C. Lavare il Ni-NTA agarosio matrice con tampone di estrazione. Incubare la risospeso, estratto precleared proteina con Ni-NTA matrice per 2 ore a RT. Lavare il Ni-NTA matrice con tampone di estrazione contenente 12 mM imidazolo. Eluire la proteina lentamente con 15 ml di tampone di eluizione contenente 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM imidazolo, 8 M urea, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA e 10 mM β-ME. Dializza la proteina graduale di PBS pH 7,4 contenente 10 mM β-ME. Dal 1 ° L cultura batterica di partenza, è possibile isolare fino a 50 mg di ricombinante DISC1 (598-785) protein. α-sinucleina ripiegamento Per esperimenti con α-sinucleina, 500 microgrammi della proteina ricombinante (Sigma-Aldrich, USA) è stato sciolto in PBS ad una concentrazione di 1 mg / ml. Per ottenere oligomeri, ripiegatura è stata eseguita la notte a 37 ° C, come descritto in una pubblicazione precedente 10. 5. Etichettatura di DISC1 ricombinante (598-785) con DyLight594 Prima del processo di etichettatura successivo, DISC1 (598-785) proteina ha la essere liberato dalla β-ME. Pertanto, la proteina viene dializzato 3 volte al PBS pH 7,4 ad una diluizione di 1:2000. Etichetta 1 mg DISC1 (598-785) con DyLight 594 maleimide (Thermo Scientific, USA) secondo le istruzioni del produttore. In breve, sciogliere 1 mg / ml di proteina in PBS pH 7,4 e si aggiungono 5 TCEP mM di recuperare liberi gruppi tiolici. Aggiungere 20 ml di DMF colorante disciolto nella reazione e incubare per 2 ore a RT. 3 x dializza la proteina di PBS pH7,4 con un rapporto di 1:2000 per 2 h ciascuna. Per aumentare ulteriormente la purezza della proteina etichettata una sua 6-etichettato affinità basata-purificazione su una colonna di Ni-NTA viene eseguita. Lavare 1 ml Ni-NTA matrice (Qiagen, Germania) con 10 ml di PBS pH 7,4. Applicare l'etichetta, proteine ​​dializzato alla colonna e farlo funzionare sulla colonna lentamente. Lavare la proteina con 3 x 20 ml di PBS pH 7,4 Eluire la proteina con PBS pH 7,4, 500 mM imidazolo gocce monitorando la banda colorata sulla colonna Ni-NTA per ridurre il volume eluato. Dializza l'eluato a 3 x 10 mM pH 7,4 napi ad una diluizione di 1:2000 per 2 h ciascuna. Utilizzare una siringa sterile 0,45 micron filtro per filtrare l'eluato, aliquota in 5 x 100 campioni ul e congelare in azoto liquido a scatto. La quantità totale di proteine ​​dovrebbe essere di 0,5-1 mg / ml in ciascuna aliquota 100 ul. opzionale Concentrazionezione passo Per iniezioni stereotactical ratto, la proteina è stata concentrata 10 volte in una velocità-vac (Concentratore Eppendorf 5301). La condizione di buffer finale era di 100 Napi mM. α-sinucleina Etichettatura L'etichettatura e purificazione (Ni-NTA colonna) ricombinante della α-sinucleina è stata eseguita in parallelo DISC1 (598-785). Il materiale di partenza è stato totale 500 mg invece di 1 mg per DISC1 (598-785). 6. Trattamento dei destinatari cellule SH-SY5Y con etichetta ricombinante DISC1 (598-785) Proteine Seme 5×10 4 destinatario SH-SY5Y neuroblastoma umano costitutivamente esprimono GFP-DISC1 (598-854) su vetrini sterili in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Aggiungi proteina marcata al mezzo di coltura cellulare ad una concentrazione di 5-10 mg / ml ed incubare per 48-72 hr. Lavare le cellule 3 x con PBS pH 7.4 e dissetare estrazionefluorescenza ellular con il 0,04% Trypan Blue per 5 min. Fissare le cellule con 4% PFA in PBS pH 7.4 per 10 min in ghiaccio, lavare una volta con sterile H 2 O e montare i coprioggetti su vetrini con prolungare oro con DAPI montaggio medio (Invitrogen, USA). Confermare l'assorbimento / invasione di proteina ricombinante esogena applicata da colocalizzazione con proteine ​​assunti espresse da cellule riceventi in Z-stack immagini generate da scansione laser microscopia confocale. Eppure, assunzione di proteina endogena potrebbe non essere rilevata sostanzialmente in parallelo con invasione di proteine ​​della cellula ospite, Z-stack immagini possono ancora confermare la natura invasiva della proteina. Nel nostro esempio, rec. DISC1 (598-785) * almeno in parte solubile reclute GFP-tagged DISC1 (598-854) proteina espressa dalla cellula ospite (vedi Figura 5A). Per ricombinante α-sinucleina invasione, ma non il reclutamento viene mostrato (Figura 5B). Le foto sono state presesu un confocale Zeiss LSM-510 o un microscopio Zeiss AxioVision Apotome2. L'iniezione del concentrato (ca. 4 pl di 2,5 mg / mL), etichettati DISC1 (598-785) * nei risultati mPFC nella diffusione della proteina intorno al sito di iniezione, che può essere rilevato anche dopo perfusione dell'animale con 4% PFA in PBS pH 7,4 con una filterset rodamina. Nel nostro esempio DISC1 (598-785) è occupata da una serie distinte di neuroni e può essere monitorato con Z-stack di immagini (Figura 6). In generale, l'iniezione di altre proteine ​​poi quelle qui utilizzato non comportano necessariamente invasione cellulare. L'evento invasione dipende essenzialmente dalla natura della proteina, tuttavia una purificazione pulita è un prerequisito per ulteriori analisi. 7. Risultati rappresentativi Aggresomes costituiti ricombinante DISC1-eGFP FL purificato da cellule NLF invaso destinatario SH-SY5Y ceLLS a bassa efficienza (circa 0.3% 5), come visto da colocalizzazione con microscopia confocale (Figura 3). Come precedentemente segnalato, DISC1 (598-785) espressa e purificata da E. coli formano multimeri 4 erano ugualmente cellula-invasiva ad un'efficienza di circa il 20% 5 (figura 5A), simile a quella di α-sinucleina che è stato utilizzato in parallelo come controllo positivo (Figura 5B). Labeled DISC1 ricombinante (598-785) espressa e purificata da E. coli è stato anche cellule invasive ai neuroni in vivo quando la proteina è stata multimerico stereotassica iniettato nella corteccia prefrontale mediale di un topo (figura 6; Pum, Bader, Huston, Korth, non pubblicato). Figura 1. Cellule di neuroblastoma NLF transitoriamente esprimere FP-DISC1 (rosso). Red aggresomes fluorescenti possono essere deteCTED all'interno delle cellule. Figura 2. Purificata MRFP-tagged DISC1 aggresomes dopo la purificazione in un gradiente di saccarosio. Figura 3. Immagine fluorescente di aggresomes invaso. MRFP-tagged flDISC1 aggresomes sono stati purificati e incubate con cellule SH-SY5Y neuroblastoma overexpressing solubile GFP-tagged DISC1 (598-854). La presa di una aggresomes etichettati è monitorata da Z-stack immagini su un Laser-Scan microscopio (Zeiss LSM 510). Figura 4. SEC-profilo di rec. DISC1 (598-785) contenente la S704 e C704 polimorfismi a singolo nucleotide (SNP). Entrambe le varianti mostrano una perturbazione di oligomerizzazione ordinata e la formazione di alto peso molecolare multemporizzatori (freccia rossa). Questa immagine è modificata rispetto alla pubblicazione di Leliveld et al., Biochimica 2009. Figura 5. Fluorescente Z-pila di foto di invasivo DyLight marcato DISC1 ricombinante (598-785). SH-SY5Y neuroblastoma esprimenti GFP-solubile DISC1 (598-854) sono state incubate con etichettati, proteina ricombinante ad una concentrazione di 5 mg / ml. (A) aggregati rossa mostra l'invasione di rec. DISC1 (598-785), proteine ​​e punti gialli indicano una assunzione di solubile GFP-DISC1 (598-854) in aggregati. (B) ricombinante α-sinucleina (rosso) invade le cellule senza assunzione con una frequenza di circa il 20%. Clicca qui per ingrandire la figura . Figura 6. Immagine di immunofluorescenzal'etichetta iniettato, DISC1 ricombinante (598-785) della proteina. Z-stack immagini conferma la presenza di rec. DISC1 (598-785) proteina in neuroni corticali di ratto colorate con un anticorpo contro nuclei neuronali (NeuN, verde).