جيل وتنقية، وتوصيف الأنواع الغازية خلية البروتين DISC1
Özet
الجيل، وتنقية الخلايا غزو، السيتوبلازمية داخل الخلايا كامل طول البروتين aggresomes DISC1 من مزارع الخلايا لو، multimeric المسمى المؤتلف جزء من البروتين في DISC1<em> E. القولونية</em> موصوفة. ويرد الغزو الخلية لخلايا المتلقي في خلية ثقافة والخلايا العصبية لل<em> في الجسم الحي</em> بعد التلقيح الدماغ stereotactical.
Abstract
وينظر تجميع البروتين باعتباره السمة المميزة العامة المزمن، وظروف الدماغ التنكسية مثل، على سبيل المثال، في أمراض الاعصاب مرض الزهايمر (Aβ، تاو)، ومرض باركنسون (α-synuclein)، مرض هنتنغتون (polyglutamine، huntingtin)، وغيرها. ويعتقد تجميع البروتين لتحدث نتيجة لاضطراب proteostasis، أي عدم التوازن بين الناشئة وتدهور البروتينات تتجمع. من المذكرة، تم العثور على البروتينات نفس تجميعها في أشكال متفرقة من هذه الأمراض التي هي متحولة في المتغيرات النادرة من أشكال العائلية.
الفصام هو حالة مزمنة الدماغ التقدمية التي في كثير من الحالات يسير جنبا إلى جنب مع العجز المعرفي دائمة لا رجعة فيها. في نهج مرشح الجينات، ونحن التحقيق ما إذا كان يمكن العثور على تعطل في والفصام 1 (DISC1)، استنساخ الجين في أسرة الاسكتلندي مع الربط للأمراض العقلية المزمنة 1 و 2، وغير قابلة للذوبان المجاميع في المخن من حالات متفرقة من الفصام 3. باستخدام CC SMRI، حددنا في ما يقرب من 20٪ من الحالات ولكن ليس مع CMD الضوابط العادية أو المرضى الذين يعانون من أمراض الاعصاب تفاعلية مناعية DISC1 sarkosyl غير قابلة للذوبان بعد تجزئة البيوكيميائية. كشفت دراسات لاحقة في المختبر أن تأثر الميل تجميع DISC1 من تعدد الأشكال من الأمراض المرتبطة بها S704C 4، والتي ولدت DISC1 aggresomes في المختبر كانت الخلية الغازية 5، على غرار ما كان قد تعرض لAβ 6، تاو 7-9، α synuclein-10، polyglutamine 11، أو المجاميع SOD1 12. دفعت هذه النتائج لنا أن أقترح أن ما لا يقل عن مجموعة فرعية من الحالات مع CMD، مع تلك DISC1 المجمعة قد تكون اضطرابات البروتين بتكوين.
نحن هنا وصف الطريقة التي تولد DISC1 aggresomes في خلايا الثدييات، تنقية لهم على التدرج السكروز واستخدامها لخلية الغزو ستوديوفاق. وبالمثل، نحن تصف كيفية إنشاء multimeric حصريا محطة C-DISC1 جزء، والتسمية وتطهيره للدراسات الغزو الخلية. باستخدام multimers المؤتلف من DISC1 نحقق مماثلة الغزو خلية أما جزء α-synuclein الاصطناعية المسمى بالمثل. نعرض أيضا أن يتم أخذ هذه القطعة حتى عندما تم حقنها في الجسم الحي stereotactically في الدماغ من الحيوانات المتلقية.
Protocol
Discussion
في هذه الدراسة وصفنا عملية تنقية mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes من الخلايا العصبية خط بالنقل، إعداد ووضع العلامات من نوع البروتين المؤتلف DISC1 وتطبيقها في الخلية الغزو تجارب الخلايا المتلقية في التجارب المختبرية والحية.
وقد تم تطوير عملية تنقية aggresomes mRFP/eGFP-DISC1 الأصلية من البروتوكولات لعزل ليوي الجسم مثل الهياكل وأكبر المجاميع 13 و 14، ولكن تعديل لتجنب استخدام المنظفات وتقليل خطر إيجابية كاذبة الخلية الغزو التي قد تحدث بسبب اختراق الغشاء المنظفات الميسرة.
يمكن للمرء تحسين محتملة في المستقبل يكون في لزيادة نقاء aggresomes من صوتنة إلى الأغشية منفصلة تماما المتبقية والهيكل الخلوي من aggresomes. بواسطة نقاء العام زيادة، وعدد من الأحداث التي سجلت إجمالي غزو لأماه aggresomes كبيرةيمكن زيادة Y 5. وينبغي النظر في ما إذا كان تعريف محدود من السكروز لدينا 3-المرحلة اقترح كافية لaggresomes الأنواع الأخرى البروتين لابد من اختبارها، وبهذا المعنى البروتوكول المذكورة هنا كنقطة انطلاق لتعظيم الاستفادة الفردية. أثبتت aggresomes المنقى أن تكون قوية جدا في أيدينا، غسل خطوات إضافية (بدون المنظفات) للقضاء على آثار من السكروز لم تقلل كثيرا من العائد الكلي.
في منشور السابقة صفنا هذا التجميع قليل وحدات من DISC1 يعتمد على المجالات multimerization متميزة في محطة سي 4 (الشكل 4). اخترنا هذا الجزء لالمؤتلف التعبير القابلة للذوبان في E. القولونية وتنقية لاحقة وني NTA. لرصد وmultimerization لمقارنة الغزو في الخلية مع خلية البروتين الغازية مثل وصف α-synuclein، وصفت ونحن DISC1 (598-785) مع صبغة الفلورسنت DyLight594، ومقارنة لهاخلية الغزو مع أن المسمى بنفس القدر من α-synuclein. وزادت بشكل كبير من الخلايا الغازية من جزء DISC1 المؤتلف مقارنة بما كان عليه من طول، الوطنية الكاملة DISC1 aggresomes، من المحتمل بسبب صغر حجمها ونقاوة أعلى من ذلك بكثير. مرة أخرى، يبدو أن نقاء تلعب دورا حاسما في الغزو الخلية.
في مثالنا جند aggresomes الغازية القابلة للذوبان البروتين نديد هدف خط الخلية التي أعرب recombinantly في ذوبان، وشكل خلية فرقت أي. التعبير عن بروتين الفلورية (مثل GFP أو RFP) في المتلقي خط الخلية هي ميزة لأنها تسمح للcolocalization من aggresomes الغازية والبروتينات المؤتلف ضمن المستفيدة الحد الخليوي عبر Z-كومة التصوير.
aggresomes DISC1 الخلايا الغازية وشظايا multimeric أعرب وتنقيته من E. يمكن أن تكون الإشريكية السمة المميزة لأمراض البروتين المتصلة بتكوين DISC1، DISC1opathies 15.
اطلاق النار المتاعب:
aggresome العائد المنخفض بعد التدرج تنقية السكروز:
التدرج السكروز التي أدخلت في هذا البروتوكول يعمل بشكل جيد مع aggresomes (FL) eGFP/mRFP-DISC1. قد تتكون من البروتينات Aggresomes أخرى تكون ذات أبعاد متغيرة ولذلك يجب أن يكون الأمثل للتركيز السكروز من قبل مستخدمين آخرين.
عدم كفاية البروتين المؤتلف تنقية:
وينبغي على كل الملوثات البكتيرية في عملية تنقية البروتين المؤتلف يكون المسمى في خطوات لاحقة من البروتوكول. لتجنب التلوث، تشغيل البروتين على SDS-PAGE وتؤكد أن البروتين المؤتلف هو لا يقل عن 95٪ نقية من تلطيخ مع Coomassie أزرق. لضمان أعلى مستويات الجودة والإنتاجية، وبروتوكول يجب أن يكون الأمثل لكل فرد البروتين.
انخفاض العلامات EFficiency من البروتينات المؤتلف:
فإن أي التلوث التي تحتوي على مجموعات حرة SH-تقليل كفاءة وضع العلامات من البروتين. ولذلك، غسيل الكلى واسعة وني NTA تنقية القائمة على إلزامي.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل الخلايا العصبية، ERANET اكتشاف (BMBF 01EW1003) لCK وJPH، DFG (كو 1679/3-1؛ GRK1033) لCKVB معتمد من قبل منحة من Forschungskommission من كلية الطب في جامعة دوسلدورف.
Materials
| Reagent name | Company | Catalog number | Yorumlar | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | Medium is dependent on the host cell line. The optimal recipient cell line should be determined by the user. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DMEM/F-12 | Invitrogen | 11320-033 | Medium is dependent on the recipient cell line. The optimal recipient cell line should be determined by the user. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PBS | Invitrogen | 14190-250 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Metafectene | Biontex | T020-1.0 | Other transfection reagents might work as well but were not tested with our protocol. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | The experiments were done with Ni_NTA agarose from Qiagen, other suppliers should work as well. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DNase I | Roche | 04716728001 | There is no need for RNase free DNase in the process of aggresomes purification. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-062 | Serum-free medium works as well | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | Supplement for SH-SY5Y and NLF medium | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Non-essential-amino-acids (NEAA) | Sigma-Aldrich | M7145 | Supplement for SH-SY5Y medium | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Trypan Blue 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154 | Toxic reagent | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DyLight 594 Maleimide | Thermo-Fisher Scientific | 46608 | Reduced cysteine reactive dye to form stable thioether bonds. Also available in other colors. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ProLong Gold with DAPI | Invitrogen | P36935 | This antifade liquid mountant gave superior results in our hands. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Protease Inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | Dissolve 1 table in 500 μl H2O for 100X solution. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Synthetic a-synuclein | Sigma | S7820 | Refold as described in text. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Table of specific reagents. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Precellys 24 | Bertin Technologies | 03119.200.RD000 | We have not tested other mechanical homogenizers other than this. Other detergent free homogenization method might work as well, but have not been tested for this protocol. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 5301 Concentrator (speedvac) | Eppendorf | 5301 000.210 | Only necessary if protein has to be concentrated. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| LSM 510 and Axiovision Apotome2 | Zeiss | See manufacturers catalog | Both microscopes harbor the ability to perform Z-stack imaging. This is a prerequisite for solid and serious evaluation of invasion events. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Cell culture plastic material | Nunc | 10 cm dishes #172958, 24-well plates #142475 | The use of different plastic material might influence the interaction of recombinant proteins or aggresomes and the plastic surfaces. We have not tested materials other than the ones described here. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Table of specific material and equipment. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Referanslar
- Millar, J. K. Disruption of two novel genes by a translocation co-segregating with schizophrenia. Hum. Mol. Genet. 9, 1415-1423 (2000).
- St Clair, D. Association within a family of a balanced autosomal translocation with major mental illness. Lancet. 336, 13-16 (1990).
- Leliveld, S. R. Insolubility of disrupted-in-schizophrenia 1 disrupts oligomer-dependent interactions with nuclear distribution element 1 and is associated with sporadic mental disease. J. Neurosci. 28, 3839-3845 (2008).
- Leliveld, S. R. Oligomer assembly of the C-terminal DISC1 domain (640-854) is controlled by self-association motifs and disease-associated polymorphism S704C. Biyokimya. 48, 7746-7755 (2009).
- Ottis, P. Convergence of two independent mental disease genes on the protein level: recruitment of dysbindin to cell-invasive disrupted-in-schizophrenia 1 aggresomes. Biol. Psychiatry. 70, 604-610 (2011).
- Meyer-Luehmann, M. Exogenous induction of cerebral beta-amyloidogenesis is governed by agent and host. Science. 313, 1781-1784 (2006).
- Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell. J. Biol. Chem. 284, 12845-12852 (2009).
- Frost, B., Ollesch, J., Wille, H., Diamond, M. I. Conformational diversity of wild-type Tau fibrils specified by templated conformation change. J. Biol. Chem. 284, 3546-3551 (2009).
- Clavaguera, F. Transmission and spreading of tauopathy in transgenic mouse brain. Nat. Cell Biol. 11, 909-913 (2009).
- Desplats, P. Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 13010-13015 (2009).
- Ren, P. H. Cytoplasmic penetration and persistent infection of mammalian cells by polyglutamine aggregates. Nat. Cell Biol. 11, 219-225 (2009).
- Munch, C., O’Brien, J., Bertolotti, A. Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 3548-3553 (2011).
- Iwatsubo, T. Purification and characterization of Lewy bodies from the brains of patients with diffuse Lewy body disease. Am. J. Pathol. 148, 1517-1529 (1996).
- Meriin, A. B., Wang, Y., Sherman, M. Y. Isolation of aggresomes and other large aggregates. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, 1-9 (2010).
- Korth, C. DISCopathies: brain disorders related to dysfunctional DISC1. Rev. Neurosci. 20, 321-330 (2009).
