셀 침습적 DISC1 단백질 종의 생성, 정제 및 특성

1. Aggresome 기증자 세포의 준비 : Monomeric 레드 형광 단백질 (mRFP) 또는 향상된 그린 형광 단백질 (eGFP) 태그 인간 전체 길이 (FL) DISC1의 Transfection 종자 1.5 X 10 6 / 10cm 접시 인간의 neuroblastoma NLF (NLF, 필라델피아의 어린이 병원, 필라델피아, PA) 열 10cm 요리의 세포와 하룻밤 성장합니다. NLF 전지는 10 % 보충 RPMI-1640 배지에서 배양 아르 FBS, 페니실린 / Strepomycin, L-글루타민. 다음 날, 세포는 70-80% confluency에 있어야합니다. Transiently 15 μg 플라스미드 DNA와 Metafectene transfection 시약 (Biontex, Martinsried, 독일)가 각각 10cm의 접시를 transfect. 간단히 말하자면, 10cm 요리에 대해, 15 μg 플라스미드 DNA와 30 μl Metafectene는, 750 μl Opti-가상에 추가 혼합 20 분 동안 RT에서 incubated되었습니다. 5 요리 pcDNA3.1 mRFP / eGFP-플라스미드 혼자있는 eGFP 태그 인간 (FL) DISC1 5 요리와 transfected했다. 2. AggresomeTransfected 기증자 세포의 정화 여기에 설명 된 프로토콜은 뇌 조직의 13 대형 집계 및 aggresomes 14 분리 할 수있는 프로토콜에서 Lewy – 몸을 정화 할 수있는 방법의 조합입니다. 이미 기존 방법은 세제의 사용, 세포 invasiveness의 assays의 응용 프로그램에 대한 세제없는 단백질의 고립을 기반으로하기 때문에 중요합니다. 48 시간 transfection 후, eGFP 및 mRFP/eGFP-DISC1의 표현을 모니터링하고 형광 현미경 (그림 1)에서 aggresomes의 형성을 확인합니다. 1X 프로테아제 억제제 칵테일을 추가 (로슈, 인디애나 폴리스, IN)와 Precellys24 균질 (Bertin 기술, 프랑스)를 사용하여 셀을 방해, PBS 산도 7.4, 400 μl PBS 각과 흠집으로 세포를 씻으십시오. 간단히, 2 ML의 용해 튜브에 1 ML 세포 현탁액을 추가하고 열 세라믹 구슬을 추가합니다. 3 개 60 초 펄스로 세포를 Lyse. 프로세스의 기계적 힘은 할 수있다37 위의 샘플 내에서 온도를 증가 ° C 있으므로주의가 용해 절차 후 얼음에 샘플을 냉각하기 위해주의해야한다. 얼음에 세포를 시원하고 37 60 분 10 MM MgCl 2, 40 U / ML DNase 및 배양을 추가 ° C 80 % 솔루션, 50 %, PBS의 pH를 7.4 (10 ML 각)에 20 %의 자당 (w / V)를 준비합니다. 50 % 20 % 다음, 2 ML 80 % 자당로 시작, 15 ML 팔콘 튜브에 자당 기울기를 준비합니다. 천천히 기울기를 넣어 이미 부어 레이어를 방해하지 않도록주의하십시오. 4 번 레이어 1,000 XG에서 15 분의 기울기와 원심 분리기 위의 소화 lysate를 ° C. 조심스럽게 PBS 산도 7.4의 5 권과 피펫과 혼합으로 50-80%의 자당 층 사이의 계면를 수집합니다. 4 ° C.에서 1,000 XG 15 분 동안 원심 분리기 두 개의 추가 번 세척 반복합니다. 이 계면에서 aggresomes는 형광 있으며, UV 빛 아래에서 현미경으로 시각화 할 수 있습니다. 표면에 뜨는을 취소하고250-500 μl PBS의 산도를 7.4에서 펠렛을 resuspend. 이 펠렛은 정화 aggresomes (그림 2)가 포함되어 있습니다. 3. mRFP/eGFP-DISC1 Aggresomes로받는 SH-SY5Y 세포 치료 종자 5 X 10 4받는 SH-SY5Y 인간 neuroblastoma 세포 constitutively 24 잘 플레이트의 각 잘에 멸균 유리 coverslips에 GFP-DISC1 (598-854)를 표현. SH-SY5Y 세포는 페니실린 / 스트렙토 마이신, 비 필수 아미노산 (NEAA)와 10 % FBS와 보충 DMEM/F-12 매체에 배양되어 있습니다. 24 시간 후, 각도에 10 μl를 추가하고 48-72 시간에 품다. PBS 산도 7.4으로 세포에게 3 x를 깨끗이 씻어 5 분에 0.04 % Trypan 파랑과 세포 형광을 해소. 얼음에 10 분 동안 PBS 산도 7.4의 4% PFA으로 세포를 수정, DAPI 장착 매체 (Invitrogen, USA)와 골드를 연장으로 멸균 H 2 O로 한 번 씻고, 유리 슬라이드에 coverslips를 탑재합니다. / 이해를 확인Z-스택 이미지에받는 사람 세포에 의해 표현 모집 단백질과 colocalization로 exogenously 적용 aggresomes의 침략. 그러나 외인성 단백질의 이해 / 침략은 본질적으로 숙주 세포 단백질 모집과 병렬로 감지되지 않을 수 있습니다. 이 예에서는 mRFP는 태그 DISC1 aggresomes 모집 용해 GFP 태그 DISC1 (598-854) 숙주 세포 (그림 3 참조)에 의해 표현 단백질을. 사진은 Zeiss LSM 510 공 촛점 또는 Zeiss Axiovision Apotome2 현미경에 촬영 된 것입니다. 4. 재조합 DISC1의 세대 (598-785) 이전 발행물에서 우리는 자기 협회 도메인의 존재에 따라 자기 상호 작용에 다양한 DISC1 단백질 조각의 능력을 분석했다. 모든 단백질 중에는 인간의 DISC1 (598-785)는 (그림 4) 강한 multimerization 성향에게 4 표시 테스트 조각. 따라서, 인간 DISC1 (598-785)가 (없음 pET15b으로 복제 된vagen, 매디슨, 위스콘신)은 E. 표현 6 히스티딘 태그 N-터미널을 포함 대장균 BL21-(lDE3)이 로제 (Novagen, 미국), 그리고 4에 설명 된대로 8 몰 / 리터 요소의 denaturing 조건 하에서 정화. 즉, 프로토콜은 아래 설명되어 있습니다. BL21-(IDE3) 로제 E. 대장균은 OD 600 5mM 5 MM-아르기닌-HCL, MGSO4, 100 μg / ML carbencillin, 35 μg / ML chloramphenicol을 포함하는 2 X 500 ML 2YT에서 재배되었습니다 0.6-0.8와 DISC1 (598-785) 표현식은 유도 된 1 ㎜의 IPTG를 갖추고 있습니다. DISC1 (598-785)가 37 ° C에서 4 시간에 표현 된, 그 표현은 원심 분리하여 박테리아를 수확하여 종료되었습니다. 박테리아 펠렛은 50 ML TE 버퍼 (50 MM 트리스 – HCL 산도 8.0, 5 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))와 2 MM PMSF, 1 % TX-100, 250 μg / ML 라이소자임, 20 MM MgCl 2, 400 U/50 ML에 resuspended되었습니다 완전한 용해을 보장하기 위해 DNase I.는, 반응은 부드러운 저어와 RT 30 분 동안 incubated되었습니다. β-mercapt 10 MM을 추가또 다른 30 ​​분에 oethanol (ME), 500 MM NaCl 및 품다. 4 ° C. 30 분에 20.000 g에 세균 포함기구를 스핀 다운 Resuspend 펠릿 50mM 트리스 산도 8.0, 5 MM 이미 다졸, 500 MM NaCl, 8 M의 요소와 10 MM β-ME를, 4시 30 분에 20.000 g에서 원심 분리하여 오염 물질을 제거 ° C.를 포함하는 50 ML 추출 버퍼에 추출 버퍼와 니켈 NTA 아가로 오스 행렬을 씻으십시오. RT에서 2 시간에 니켈 NTA 매트릭스와 resuspended, precleared 단백질 추출물을 품다. 12 MM 이미 다졸을 포함하는 추출 버퍼와 니켈 NTA 행렬을 씻으십시오. 50 ㎜ 트리스, 500 MM NaCl, 300 MM 이미 다졸, 8 M 우레아, 1 MM PMSF, 5 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)와 β-ME 10 MM를 포함하는 15 ML의 용출 버퍼와 함께 천천히 단백질을 Elute. β-ME 10 MM를 포함하는 PBS 산도 7.4에 stepwise 단백질을 Dialyze. 1 L 세균 시작 문화에서 그 재조합 DISC1 (598-785) 제자의 50 밀리그램까지 분리 할 수​​ 있습니다EIN. α-synuclein의 refolding α-synuclein의 경우, 재조합 단백질 500 μg (시그마 – 알드리치, USA)와 실험은 1 MG / ML의 농도에 PBS에 용해되었다. oligomers를 구하려면 refolding이 37 박을 수행 한 ° C로 이전 간행물 10에 설명되어 있습니다. 5. DyLight594와 재조합 DISC1 (598-785)의 라벨 이전 다음 라벨 프로세스 DISC1 (598-785)는 단백질은 β-ME에서 해방 될 수있다. 따라서 단백질은 1:2,000의 희석에 PBS 산도 7.4-3 시간을 dialyzed 있습니다. 라벨 1 제조업체의 지침에 따라 DyLight 594 maleimide (열 과학, USA)와 MG DISC1 (598-785). 즉, PBS 산도 7.4에서 1 MG / ML 단백질을 분해 및 무료 thiol 그룹을 복구 할 5 밀리미터 TCEP를 추가합니다. RT에서 2 시간의 반응과 배양에 DMF 용해 염료의 20 μl를 추가합니다. PBS 산도에 단백질 3 개를 Dialyze2 1:2000의 비율로 7.4 각을 시간. 추가로 표시된 단백질의 순도를 높이기 위해 그의 6 태그 니켈 NTA 열이 수행에 친 화성 – 정화 기반. 10 ML PBS 산도 7.4 1 개 ML 니켈 NTA 매트릭스 (Qiagen, 독일)을 씻으십시오. 열에 표시, dialyzed 단백질을 적용하고 천천히 열을 통해 실행할 수 있습니다. 3 개 20 ML PBS의 산도를 7.4으로 단백질을 씻어 eluate 볼륨을 줄이기 위해 니켈 NTA 컬럼에 색 대역을 모니터링하면서 PBS 산도 7.4, 500 MM 이미 다졸 dropwise과 단백질을 Elute. 2 시간 각 1:2000의 희석 10 MM NaPi 산도 7.4에 eluate 3 개를 Dialyze. eluate, 액체 질소에 5 × 100 μl 샘플 및 스냅 동결에 나누어지는을 필터링하는 필터 살균 0.45 μm의 주사기를 사용합니다. 각 100 μl 나누어지는 1 μg / ML – 단백질의 총 금액은 0.5이어야합니다. 선택 concentration 단계 stereotactical 쥐 주사를 들어, 단백질은 속도 VAC (Eppendorf 집중 장치 5301)에 10 배 농축되었다. 최종 버퍼 상태는 100 밀리미터 NaPi했다. α-synuclein의 라벨링 재조합 α-synuclein의 라벨 및 정화 (니켈 NTA 열) DISC1 (598-785)에 병렬로 수행되었다. 총 출발 물질은 500 μg 대신 DISC1 (598-785) 1 밀리그램했다. 6. 레이블 재조합 DISC1 (598-785) 단백질과받는 SH-SY5Y 세포 치료 종자 5×10 4받는 SH-SY5Y 인간 neuroblastoma 세포는 constitutively 24 잘 플레이트의 각 잘에 멸균 유리 coverslips에 GFP-DISC1 (598-854)를 표현. 5-10 μg / ML의 농도에서 세포 배양 매체에 표시된 단백질을 추가하고 48-72 시간에 품다. PBS 산도 7.4으로 세포에게 3 x를 깨끗이 씻어 extrac을 해소5 분에 0.04 % Trypan 파랑과 ellular 형광. 얼음에 10 분 동안 PBS 산도 7.4의 4% PFA으로 세포를 수정, DAPI 장착 매체 (Invitrogen, USA)와 골드를 연장으로 멸균 H 2 O로 한 번 씻고, 유리 슬라이드에 coverslips를 탑재합니다. 레이저 공 촛점 현미경을 스캔에 의해 생성 된 Z-스택 이미지에받는 사람 세포에 의해 표현 모집 단백질과 colocalization하여 재조합 단백질을 적용 exogenously의 이해 / 침략을 확인합니다. 그러나 내생 단백질 모집은 기본적으로 숙주 세포 단백질의 침략과 병렬로 감지되지 않을 수도 있습니다, Z-스택 이미지가 여전히 단백질의 침해 자연을 확인할 수 있습니다. 우리의 예를 들어 REC합니다. DISC1 (598-785) * 최소 부분 모집에 용해 DISC1 (598-854) 숙주 세포 (그림 5A를 참조)에 의해 표현 단백질을 GFP 태그. 재조합 α-synuclein의 침략 있지만 모집합니다 (그림 5B) 표시됩니다. 사진이 촬영 된Zeiss LSM 510의 공 촛점 또는 Zeiss Axiovision Apotome2 현미경. 집중의 주입으로도 동물의 재관류 후 감지 할 수있는 주사 사이트 주변의 단백질의 확산에 mPFC 결과에 DISC1 (598-785) *로 표시 (2.5 μg / μl의 ca. 4 μl), rhodamine의 filterset와 PBS 산도 7.4의 4퍼센트 PFA. 이 예에서는 DISC1 (598-785)은 뉴런의 고유 한 숫자에 의해 촬영되어 있으며 Z-스택 영상 (그림 6)에 모니터링 할 수 있습니다. 일반적으로 사람들이 여기서 사용하여 다른 단백질의 주입이 반드시 셀 침략으로 이어질하지 않습니다. 침공 이벤트가 단백질의 특성에 근본적으로 의존 그럼에도 불구하고 깨끗한 정화는 추가 분석을 위해 필수입니다. 7. 대표 결과 NLF 세포에서 재조합 FL DISC1-eGFP 정화 구성된 Aggresomes는받는 SH-SY5Y CE를 침공낮은 효율의 재편 (약 0.3 % 5) 등의 공 촛점 현미경 (그림 3)과 colocalization 볼. 이전에보고 된 바와 같이, DISC1 (598-785)는 표현과 E.에서 정화 대장균은 multimers 4 긍정적 인 제어 (그림 5B)로 병렬로 사용 된 α-synuclein 그와 유사한 약 20 % 5 (그림 5A)의 효율성을 동일하게 휴대 침습적 있었다 형성했다. 표시 재조합 DISC1 (598-785)는 표현과 E.에서 정화 multimeric 단백질이 stereotactically 쥐의 내측 전두엽 피질 (; Pum, 베이더, 휴스턴, Korth, 게시되지 않은 그림 6)에 주입했을 때 대장균은 세포 침습적 생체의 뉴런을했다. 그림 1. NLF의 neuroblastoma 세포는 transiently FP-DISC1 (빨간색)를 표현. 레드 형광 aggresomes는 dete 수 있습니다세포 내에서 cted. 그림 2. 자당 기울기에서 정화 한 후 DISC1 aggresomes을 mRFP 태그 정화. 그림 3. 침략 aggresomes의 형광등 그림. mRFP 태그 flDISC1 aggresomes는 SH-SY5Y neuroblastoma 세포와 정화와 incubated되었습니다 overexpressing 용해 GFP 태그 DISC1 (598-854)을. 분류 aggresomes의 이해는 레이저 스캔 현미경 (Zeiss LSM 510)에 Z-스택 영상에 의해 모니터링된다. 그림 4. REC의 SEC – 프로필입니다. S704과 C704 단일 염기 polymorphisms (SNP)을 포함 DISC1 (598-785). 두 변종은 주문 oligomerization의 중단과 높은 분자량의 복수의 형성을 보여imers (빨간색 화살표). 이 사진은 Leliveld 외의 기사., 생화학 2009 수정됩니다. 그림 5. 침해 DyLight – 라벨 재조합 DISC1 (598-785)의 형광 Z-스택 사진. 수용성 GFP-DISC1 (598-854)를 표현 SH-SY5Y의 neuroblastoma 세포가 표시와 incubated되었습니다, 5 μg / ML의 농도에서 재조합 단백질. (A) 레드 집계는 REC의 침략을 보여줍니다. DISC1 (598-785) 단백질과 노란색 점을 합산로 용해 GFP-DISC1 (598-854)의 영입을 나타냅니다. (B) 재조합 α-synuclein (빨간색)은 20 %의 주파수로 채용하지 않고 세포를 침공. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 . 의 그림 6. Immunofluorescent 사진주입 라벨, 재조합 DISC1 (598-785) 단백질. Z-스택 영상은 REC의 존재를 확인합니다. neuronal 핵 (NeuN, 녹색)에 대한 항체 물들 쥐 대뇌 피질의 뉴런에서 DISC1 (598-785) 단백질.