Generation, Reinigung und Charakterisierung von Cell-invasive DISC1 Protein Spezies

Ein. Vorbereitung der Aggresomen Spenderzellen: Transfektion von monomerem Red Fluorescent Protein (mRFP) oder Enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP)-markierten menschlichen Full Length (FL) DISC1 Seed 1,5 x 10 6/10 cm Schale humanen Neuroblastom NLF (NLF; Kinderkrankenhaus von Philadelphia, Philadelphia, PA) Zellen in zehn 10 cm Gerichte und über Nacht wachsen. NLF Zellen werden in RPMI-1640-Medium mit 10% FBS kultiviert, Penicillin / Strepomycin, L-Glutamin. Am nächsten Tag sollten die Zellen bei 70-80% Konfluenz sein. Transient zu transfizieren jede 10 cm Schüssel mit 15 ug Plasmid-DNA und Metafectene Transfektionsreagenz (Biontex, Martinsried, Deutschland). In kurzen, für eine 10 cm Schale wurden 15 ug Plasmid-DNA und 30 ul Metafectene bis 750 ul Opti-MEM zugegeben, gemischt und bei RT für 20 min. 5 Gerichte wurden mit pcDNA3.1 mRFP / eGFP-markierten menschlichen (FL) DISC1 und 5 Gerichte mit eGFP-Plasmid allein transfiziert. 2. AggresomenReinigung aus transfizierter Donorzellen Die hier beschriebene Protokoll ist eine Kombination eines Verfahrens, um Lewy-Bodies aus Gehirngewebe 13 und einem Protokoll, um große Aggregate und Aggresomen 14 isolieren reinigen. Da bereits bestehender Verfahren auf die Verwendung von Reinigungsmitteln, die Isolierung von Detergens-freien Protein für die Anwendung bei der Zell-Assays basieren Invasivität ist kritisch. 48 h nach der Transfektion, zur Überwachung der Expression des eGFP und mRFP/eGFP-DISC1 und bestätigen die Bildung von Aggresomen unter einem Fluoreszenz-Mikroskop (Abbildung 1). Waschen Sie die Zellen mit PBS pH 7,4, kratzen mit 400 ul PBS jeder, fügen 1X Protease Inhibitor Cocktail (Roche, Indianapolis, IN) und stören die Zellen unter Verwendung eines Precellys24 Homogenisator (Bertin Technologien, Frankreich). Kurz, 1 ml Zellsuspension auf eine 2 ml Lyse überführen und 10 Keramikkugeln. Lyse der Zellen mit 3 x 60 sec Impulse. Die mechanische Kraft des Prozesses kannErhöhung der Temperatur in der Probe oberhalb 37 ° C, so ist darauf zu achten, um die Probe auf Eis nach dem Lyseverfahren Chill werden. Kühlen Sie die Zellen auf Eis und mit 10 mM MgCl 2, 40 U / ml DNase A und inkubieren für 60 min bei 37 ° C Planen Lösungen von 80%, 50%, 20% Sucrose (w / v) in PBS pH 7,4 (10 ml). Vorbereiten des Saccharosegradienten in einem 15 ml Falcon-Röhrchen, beginnend mit 2 ml 80% Saccharose, gefolgt von 50% und 20%. Gießen Sie die Steigung langsam und vorsichtig sein, nicht bereits gegossen Schichten stören. Schicht das verdaut Lysat auf der Oberseite des Gradienten und Zentrifuge für 15 min bei 1000 xg bei 4 ° C. Sorgfältig sammeln Zwischenphase zwischen der 50-80% Saccharose-Schicht mit einer Pipette und gemischt mit 5 Volumina PBS pH 7,4. Zentrifuge für 15 min bei 1000 × g bei 4 ° C. Wiederholen Waschen zwei weitere Male. In dieser Zwischenphase sind Aggresomen fluoreszierenden und visualisiert werden kann in einem Mikroskop unter UV-Licht. Überstand verwerfen unddas Pellet in 250-500 ul PBS pH 7,4. Dieses Pellet enthält das gereinigte Aggresomen (Abbildung 2). 3. Die Behandlung des Empfängers SH-SY5Y Zellen mit mRFP/eGFP-DISC1 Aggresomen Samen 5 x 10 4 Empfängers SH-SY5Y menschlichen Neuroblastomzellen konstitutiv GFP-DISC1 (598-854) auf sterilen Deckgläschen in jede Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen. SH-SY5Y-Zellen werden in Medium mit DMEM/F-12 Penicillin / Streptomycin, nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA) und 10% FBS kultiviert. 24 Stunden später, mit 10 ul in jede Vertiefung und inkubieren für 48-72 Std. Waschen Sie die Zellen 3 x mit PBS pH 7,4 und stillen extrazellulären Fluoreszenz mit 0,04% Trypanblau für 5 min. Befestigen Sie die Zellen mit 4% PFA in PBS pH 7,4 für 10 min auf Eis, einmal gründlich mit sterilem H 2 O und montieren Sie die Deckgläser auf Glasplättchen mit ProLong Gold mit DAPI Montage-Medium (Invitrogen, USA). Bestätigen Sie die Aufnahme /Invasion von exogen applizierten Aggresomen durch Kolokalisation mit rekrutiert Proteine ​​Empfänger-Zellen in Z-Stapel-Bildern ausgedrückt. Dennoch könnte Aufnahme / Invasion von exogenen Proteins nicht wesentlich parallel mit einer Rekrutierung von Wirtszellprotein detektiert werden. In unserem Beispiel mRFP-markierten DISC1 Aggresomen Rekruten lösliche GFP-markierten DISC1 (598-854)-Protein von der Wirtszelle (siehe Abbildung 3) ausgedrückt. Die Bilder wurden auf einem Zeiss LSM 510 konfokalen-oder Zeiss Axiovision Apotome2 Lupe genommen. 4. Erzeugung von rekombinanten DISC1 (598-785) In einer früheren Veröffentlichung analysierten wir die Fähigkeit verschiedener DISC1 Proteinfragmente Selbständige interagieren bezogen auf das Vorhandensein von Selbstassoziation Domänen. Unter allen Proteinfragmenten getestet menschlichen DISC1 (598-785) zeigten die stärksten Multimerisierung Anschaffungsneigung 4 (Abbildung 4). Daher wurde die menschliche DISC1 (598-785) in pET15b kloniert (NoVagen, Madison, Wisconsin) mit einem N-terminalen 6-Histidin-Tag, ausgedrückt in E. coli BL21-(lDE3) Rosetta (Novagen, USA), und unter denaturierenden Bedingungen in 8 mol / l Harnstoff als 4 beschrieben gereinigt. Kurz gesagt, wird das Protokoll unten beschrieben. BL21-(IDE3) Rosetta E. coli wurden in 2 x 500 ml 2YT gezüchtet, das 5 mM-Arginin-HCl, 5 mM MgSO4, 100 ug / ml carbencillin, 35 ug / ml Chloramphenicol bis zu einer OD 600: 0,6-0,8 und DISC1 (598-785) die Expression induziert mit 1 mM IPTG. DISC1 (598-785) für 4 h bei 37 ° C exprimiert wird, wurde die Expression durch Ernten der Bakterien durch Zentrifugation beendet. Das Bakterienpellet wurde in 50 ml TE-Puffer (50 mM TRIS-HCl pH 8,0, 5 mM EDTA) und 2 mM PMSF, 1% TX-100, 250 ug / ml Lysozym, 20 mM MgCl 2 und 400 ml resuspendiert U/50 DNase I. Um vollständige Lyse zu gewährleisten, wurde die Reaktion für 30 min bei RT unter vorsichtigem Rühren inkubiert. Hinzufügen 10 mM β-Mercaptogruppeoethanol (ME) und 500 mM NaCl und Inkubation für weitere 30 min. Spindown bakteriellen Einschlusskörperchen bei 20.000 g für 30 min bei 4 ° C. Pellet in 50 ml Extraktionspuffer, enthaltend 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM Imidazol, 500 mM NaCl, 8 M Harnstoff und 10 mM β-ME und entfernen Verunreinigungen durch Zentrifugation bei 20.000 g für 30 min bei 4 ° C. Waschen das Ni-NTA-Agarose-Matrix mit Extraktionspuffer. Inkubieren der resuspendierten, vorgereinigtes Proteinextrakt mit Ni-NTA-Matrix für 2 h bei RT. Waschen das Ni-NTA-Matrix mit Extraktionspuffer, enthaltend 12 mM Imidazol. Eluieren des Proteins langsam mit 15 ml Elutionspuffer 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM Imidazol, 8 M Harnstoff, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA und 10 mM β-ME. Dialysieren das Protein schrittweise auf PBS pH 7,4 mit 10 mM β-ME. Aus 1 L bakteriellen Startkultur ist es möglich, Isolat bis zu 50 mg rekombinanter DISC1 (598-785) protEin. α-Synuclein Rückfaltung Für Experimente mit α-Synuclein, 500 ug des rekombinanten Proteins (Sigma-Aldrich, USA) wurde in PBS in einer Konzentration von 1 mg / ml gelöst. Um Oligomere zu erhalten, Rückfaltung wurde über Nacht bei 37 ° C, wie in einer früheren Veröffentlichung 10 beschrieben. 5. Kennzeichnung von rekombinanten DISC1 (598-785) mit DyLight594 Vor der anschließenden Labelling-Verfahren, DISC1 (598-785)-Protein ist das von β-ME befreit werden. Daher wird das Protein 3 mal in PBS pH 7,4 dialysiert bei einer Verdünnung von 1:2.000. Label 1 mg DISC1 (598-785) mit DyLight 594 Maleimid (Thermo Scientific, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Kurz gesagt, löst 1 mg / ml Protein in PBS pH 7.4 und 5 mM TCEP hinzuzufügen, um freie Thiolgruppen zu erholen. Fügen Sie 20 ul der DMF gelösten Farbstoff der Reaktion und inkubieren für 2 h bei RT. Dialysieren das Protein 3 x PBS pH7,4 in einem Verhältnis von 1:2000 für 2 Stunden jeweils. Zur weiteren Steigerung der Reinheit des markierten Proteins einen His 6-Tag basierte Affinitätsreinigung auf eine Ni-NTA-Säule durchgeführt wird. Waschen 1 ml Ni-NTA-Matrix (Qiagen, Deutschland) mit 10 ml PBS pH 7,4. Anwenden des markierten, dialysierte Protein an der Säule und ließ es über die Säule langsam laufen. Waschen des Proteins mit 3 x 20 ml PBS pH 7,4 Eluieren des Proteins mit PBS pH 7,4, 500 mM Imidazol tropfenweise während der Überwachung des farbigen Band auf der Ni-NTA-Säule, das Eluat Volumen zu reduzieren. Dialysieren des Eluats 3 x bis 10 mM NaPi pH 7,4 bei einer Verdünnung von 1:2000 für 2 Stunden jeweils. Verwenden Sie eine sterile 0,45 um Spritzenfilter das Eluat, Aliquot in 5 x 100 ul Proben und Schnellfrostmedium in flüssigem Stickstoff zu filtern. 1 pg / ml in je 100 ul Aliquot – Die Gesamtmenge des Proteins sollte 0,5 sein. optional konzentration Schritt Für stereotaktische rat Injektionen, wurde das Protein 10-fach in einer Speed-Vac (Eppendorf Concentrator 5301) konzentriert. Der letzte Puffer Bedingung war 100 mM NaPi. α-Synuclein Labeling Die Markierung und Reinigung (Ni-NTA-Säule) des rekombinanten α-Synuclein wurde parallel zur DISC1 (598-785) durchgeführt. Die gesamte Ausgangsmaterial war 500 ug statt 1 mg DISC1 (598-785). 6. Die Behandlung des Empfängers SH-SY5Y Zellen mit markierten rekombinanten DISC1 (598-785) Protein Saatgut 5×10 4 Empfängers SH-SY5Y menschlichen Neuroblastomzellen konstitutiv GFP-DISC1 (598-854) auf sterilen Deckgläschen in jede Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen. Hinzufügen markiertes Protein zu dem Zellkulturmedium in einer Konzentration von 5-10 ug / ml und 48 bis 72 Stunden inkubieren. Waschen Sie die Zellen 3 x mit PBS pH 7,4 und stillen Extraktionellular Fluoreszenz mit 0,04% Trypanblau für 5 min. Befestigen Sie die Zellen mit 4% PFA in PBS pH 7,4 für 10 min auf Eis, einmal gründlich mit sterilem H 2 O und montieren Sie die Deckgläser auf Glasplättchen mit ProLong Gold mit DAPI Montage-Medium (Invitrogen, USA). Bestätigen Sie die Aufnahme / Invasion von exogen applizierten rekombinanten Proteins durch Kolokalisation mit rekrutiert Proteine ​​Empfänger-Zellen in Z-Stapel-Aufnahmen von Laser-Scanning-konfokalen Mikroskopie generiert ausgedrückt. Noch, Rekrutierung von endogenem Protein nicht könnten wesentlichen parallel Invasion Wirtszellprotein detektiert werden können Z-Stapel noch bestätigen die invasive Natur des Proteins. In unserem Beispiel rec. DISC1 (598-785) * zumindest teilweise löslich Rekruten DISC1 (598-854)-Protein durch die Wirtszelle (siehe 5A) ausgedrückt GFP-markierten. Für die rekombinante α-Synuclein Invasion, aber keine Einstellungen angezeigt wird (Abbildung 5B). Bilder aufgenommen wurdenauf einem Zeiss LSM 510 konfokalen-oder ein Zeiss Axiovision Apotome2 Mikroskop. Die Injektion der konzentrierten (ca. 4 ul von 2,5 ug / ul), beschriftet DISC1 (598-785) * in die mPFC Ergebnisse bei der Verbreitung des Proteins an der Einstichstelle, die auch nach Perfusion des Tieres mit erfasst werden kann 4% PFA in PBS pH 7,4 mit einem Rhodamin Filtersatz. In unserem Beispiel DISC1 (598-785) eingerichtet ist, durch eine bestimmte Anzahl von Neuronen entnommen und kann mit Z-Stapel bildgebenden (Abbildung 6) überwacht werden. Im Allgemeinen haben die Injektion von anderen Proteinen dann diejenigen welche hier nicht unbedingt auf Zell-Invasion führen. Die Invasion Ereignis ist im wesentlichen abhängig von der Art des Proteins, ist trotzdem eine saubere Reinigung eine Voraussetzung für eine weitere Analyse. 7. Repräsentative Ergebnisse Aggresomen bestehend aus rekombinantem FL DISC1-eGFP gereinigte vom NLF Zellen eingedrungen Empfänger SH-SY5Y cells bei niedrigen Wirkungsgrad (ca. 0,3% 5) durch Kolokalisation mit der konfokalen Mikroskopie (Abbildung 3). Wie bereits berichtet, äußerte DISC1 (598-785) und gereinigt aus E. coli gebildet Multimere 4 waren gleich Zell-invasiven bei einem Wirkungsgrad von ca. 20% 5 (5A) ähnlich dem von α-Synuclein, die parallel als positive Kontrolle (5B) verwendet wurde. Markierten rekombinanten DISC1 (598-785) exprimiert und aus E. coli war auch Zell-invasive Neuronen in vivo, wenn das multimere Protein wurde stereotaktisch in den medialen präfrontalen Kortex einer Ratte (Abbildung 6; Pum, Bader, Huston, Korth, unveröffentlicht) injiziert. Abbildung 1. NLF Neuroblastomzellen transient exprimierenden FP-DISC1 (rot). Rot fluoreszierende Aggresomen kann VerschlechterungCTED innerhalb der Zellen. Abbildung 2. Gereinigtes DISC1 Aggresomen nach der Reinigung in einem Sucrosegradienten mRFP-tagged. Abbildung 3. Fluorescent Bild überfallen Aggresomen. mRFP-markierten flDISC1 Aggresomen wurden gereinigt und mit SH-SY5Y Neuroblastomzellen inkubiert überexprimierenden lösliche GFP-markierten DISC1 (598-854). Eine Aufnahme von markiertem Aggresomen wird durch Z-Stapel Bildgebung an einem Laser-Scan-Mikroskops (Zeiss LSM 510) überwacht. Abbildung 4. SEC-Profil rec. DISC1 (598-785), das den C704 S704 und die single nucleotide polymorphisms (SNPs). Beide Varianten weisen eine Unterbrechung von geordneten Oligomerisierung und die Bildung von hochmolekularen multIMers (roter Pfeil). Dieses Bild ist von der Veröffentlichung Leliveld et al., Biochemistry 2009 geändert. Abbildung 5. Fluorescent Z-Stapel Bild invasive DyLight-markierten rekombinanten DISC1 (598-785). SH-SY5Y-Neuroblastom-Zellen, löslichen GFP-DISC1 (598-854) wurden inkubiert mit markierten, rekombinanten Proteins in einer Konzentration von 5 pg / ml. (A) Red Aggregate zeigt die Invasion der rec. DISC1 (598-785)-Protein und gelben Punkte zeigen eine Rekrutierung von löslichem GFP-DISC1 (598-854) in Aggregaten. (B) Rekombinante α-Synuclein (rot) dringt die Zellen ohne Rekrutierung mit einer Frequenz von etwa 20%. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen . Abbildung 6. Immunfluoreszenz Bilddas injizierte markierten rekombinanten DISC1 (598-785)-Protein. Z-Stapel Bildgebung bestätigt das Vorhandensein von rec. DISC1 (598-785)-Protein von Ratten kortikalen Neuronen mit einem Antikörper gegen neuronale Kerne (NeuN, grün) angefärbt.