Production, de conditionnement, et la caractérisation des cellules invasives Espèces protéine DISC1

1. Préparation des cellules donateurs Aggresome: Transfection de monomère Red Fluorescent Protein (mRFP) ou Enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP)-Longueur étiqueté humain complet (FL) DISC1 Graine de 1,5 x 10 6/10 cm neuroblastome humain plat NLF (NLF; Hôpital pour enfants de Philadelphie, Philadelphie, PA) des cellules dans dix boîtes de 10 cm et se développer durant la nuit. Cellules du FLN sont cultivées dans du RPMI-1640 supplémenté avec 10% de FBS, pénicilline / Strepomycin, L-glutamine. Le lendemain, les cellules doivent être à 70-80% de confluence. Transfecter de manière transitoire chaque plat 10 cm avec 15 pg d'ADN plasmidique et réactif de transfection Metafectene (Biontex, Martinsried, Allemagne). En bref, pour un plat de 10 cm, 15 ug d'ADN plasmidique et 30 Metafectene ul ont été ajoutés à 750 ul d'Opti-MEM, mélangés et incubés à température ambiante pendant 20 min. 5 plats ont été transfectées avec pcDNA3.1 mRFP / eGFP-étiquette de l'homme (FL) DISC1 et 5 plats avec le seul eGFP-plasmide. 2. AggresomePurification à partir de cellules transfectées donateurs Le protocole décrit ici est une combinaison d'une méthode pour purifier Lewy-organismes à partir du 13 tissu cérébral et un protocole pour isoler gros agrégats et aggresomes 14. Puisque les méthodes existantes sont basées sur l'utilisation de détergents, l'isolement des sans détergent protéines pour l'application dans la cellule-invasif des tests est cruciale. 48 heures après la transfection, contrôler l'expression de eGFP et mRFP/eGFP-DISC1 et confirmer la formation de aggresomes sous un microscope à fluorescence (Figure 1). Laver les cellules avec du PBS pH 7,4, gratter avec 400 ul de PBS chacun, ajouter 1X cocktail inhibiteur de la protéase (Roche, Indianapolis, IN) et de perturber les cellules en utilisant un homogénéisateur Precellys24 (Bertin Technologies, France). En bref, ajouter 1 ml de suspension cellulaire à un tube de 2 ml lyse et ajouter 10 billes de céramique. Lyse des cellules avec 3 impulsions x 60 sec. La force mécanique du processus peutaugmenter la température à l'intérieur de l'échantillon supérieure à 37 ° C si les soins doivent être prises pour refroidir l'échantillon sur la glace après la procédure de lyse. Refroidir les cellules sur de la glace et ajouter 10 mM MgCl 2, 40 U / ml de DNase A et incuber pendant 60 min à 37 ° C Préparer des solutions de 80%, 50%, de saccharose 20% (p / v) dans du PBS pH 7,4 (10 ml de chaque). Préparer le gradient de saccharose dans un tube Falcon de 15 ml à partir de 2 ml de saccharose à 80%, puis 50% et 20%. Verser lentement la pente et faire attention à ne pas déranger les couches déjà versé. Le lysat digéré couche au-dessus de la pente et centrifuger pendant 15 min à 1000 xg à 4 ° C. Recueillir soigneusement l'interphase entre la couche de saccharose 50-80% avec une pipette et mélanger avec 5 volumes de PBS pH 7,4. Centrifuger pendant 15 minutes à 1000 xg à 4 ° C. Répétez laver deux fois de plus. Dans cette interphase, aggresomes sont fluorescentes et peuvent être visualisées au microscope sous lumière UV. Jeter le surnageant etremettre en suspension le culot dans du PBS pH 250-500 ul 7.4. Ce culot contient le aggresomes purifiée (Figure 2). 3. Traitement des bénéficiaires cellules SH-SY5Y avec mRFP/eGFP-DISC1 Aggresomes Graine 5 x 10 4 bénéficiaires SH-SY5Y cellules de neuroblastome humain exprimant de manière constitutive la GFP-DISC1 (598-854) sur des lamelles de verre stériles dans chaque puits d'une plaque à 24 puits. SH-SY5Y cellules sont cultivées dans un milieu supplémenté avec DMEM/F-12 pénicilline / streptomycine, non-acides aminés essentiels (AANE) et 10% de FBS. 24 heures plus tard, ajouter 10 ul à chaque puits et incuber pendant 48-72 h. Laver les cellules avec du PBS 3 x pH 7,4 et éteindre la fluorescence extracellulaire avec 0,04% bleu trypan pendant 5 min. Fixer les cellules avec 4% de PFA dans du PBS pH 7,4 pendant 10 min sur la glace, laver une fois avec H 2 O stérile et monter les lamelles sur des lames de verre avec ProLong or avec DAPI milieu de montage (Invitrogen, USA). Confirmer l'absorption /invasion de manière exogène aggresomes appliquées par colocalisation avec des protéines exprimées par des cellules recrutées bénéficiaires à Z-stack images. Pourtant, l'adoption / l'invasion de la protéine exogène peut ne pas être détecté essentiellement en parallèle avec le recrutement de protéine de cellule hôte. Dans notre exemple mRFP-étiqueté DISC1 aggresomes recrue soluble GFP-étiqueté DISC1 (598-854) protéine exprimée par la cellule hôte (voir figure 3). Les photos ont été prises sur une confocal Zeiss LSM 510 ou un microscope Zeiss AxioVision Apotome2. 4. Génération de DISC1 recombinant (598-785) Dans une publication précédente, nous avons analysé la capacité de divers fragments de protéine DISC1 à l'auto-interaction basée sur la présence d'auto-association domaines. Parmi toutes les protéines humaines fragments testés DISC1 (598-785) affiché la plus forte propension à la multimérisation 4 (figure 4). Par conséquent, l'homme DISC1 (598-785) a été cloné dans pET15b (Nonvagen, Madison, Wisconsin) contenant un tag 6-histidine N-terminale, exprimé dans E. coli BL21-(lDE3) Rosetta (Novagen, États-Unis), et purifiée dans des conditions dénaturantes à 8 mol / l d'urée, comme décrit 4. En bref, le protocole est décrit ci-dessous. BL21-(IDE3) Rosetta E. coli ont été cultivées dans 2 x 500 ml 2YT contenant 5 mM-arginine-HCl, 5 mM MgSO4, 100 pg / ml carbénicilline, 35 pg / ml de chloramphénicol jusqu'à une DO 600: 0.6-0.8 et DISC1 (598-785) l'expression a été induite avec 1 mM d'IPTG. DISC1 (598-785) a été exprimé pendant 4 heures à 37 ° C, l'expression a pris fin en récoltant les bactéries par centrifugation. Le culot bactérien est remis en suspension dans 50 ml de tampon TE (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 5 mM EDTA) et 2 mM de PMSF, 1% de TX-100, 250 pg / ml de lysozyme, 20 mM de MgCl2 et 400 U/50 ml DNase I. Pour assurer une lyse complète, la réaction a été incubée pendant 30 min à température ambiante avec agitation douce. Ajouter 10 mM β-mercaptooethanol (ME) et 500 mM de NaCl et incuber pendant 30 min supplémentaires. Isoler des corps d'inclusion bactériens à 20.000 g pendant 30 min à 4 ° C. Resuspendre le culot dans 50 ml de tampon d'extraction contenant 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM d'imidazole, 500 mM de NaCl, 8 M d'urée et 10 mM β-ME et enlever les débris par centrifugation à 20,000 g pendant 30 min à 4 ° C. Laver le Ni-NTA agarose matrice avec un tampon d'extraction. Incuber la suspension d', extrait de protéine précontrôlés avec matrice Ni-NTA pendant 2 heures à température ambiante. Laver la matrice Ni-NTA avec un tampon d'extraction contenant 12 mM d'imidazole. Éluer la protéine lentement avec 15 ml de tampon d'élution contenant 50 mM de Tris, 500 mM NaCl, 300 mM d'imidazole, urée 8 M, PMSF 1 mM, 5 mM d'EDTA et 10 mM de β-ME. Dialyser la protéine par étapes pour PBS pH 7,4 contenant 10 mM de β-ME. De 1 L de culture bactérienne de départ, il est possible d'isoler jusqu'à 50 mg de recombinaison DISC1 (598-785) protein. α-synucléine repliement Pour les expériences avec α-synucléine, 500 ug de la protéine recombinante (Sigma-Aldrich, USA) a été dissous dans du PBS à une concentration de 1 mg / ml. Pour obtenir des oligomères, repliement a été effectuée durant la nuit à 37 ° C comme décrit dans une publication précédente 10. 5. L'étiquetage des DISC1 recombinant (598-785) avec DyLight594 Avant le processus de repérage ultérieur, DISC1 (598-785) protéine a être libéré de la β-ME. Par conséquent, la protéine est dialysée 3 fois au PBS pH 7,4 à une dilution de 1:2000. Étiquette 1 mg DISC1 (598-785) avec DyLight 594 maléimide (Thermo Scientific, USA) selon les instructions du fabricant. En bref, dissoudre 1 mg / ml de protéine dans du PBS pH 7,4 et ajouter 5 PTCE mM de récupérer des groupes thiols libres. Ajouter 20 ul du colorant DMF dissous à la réaction et incuber pendant 2 heures à température ambiante. Dialyser la protéine 3 x à PBS pH7,4 dans un rapport de 1:2000 à 2 heures chacune. Pour augmenter encore la pureté de la protéine marquée d'une étiquette 6-Son affinité basée sur la purification sur une colonne de Ni-NTA est effectuée. Lavez 1 ml matrice Ni-NTA (Qiagen, Allemagne) avec 10 ml de PBS pH 7,4. Appliquer l'étiquette, protéine dialysée à la colonne et le laisser tourner au-dessus de la colonne lentement. Laver la protéine avec 3 x 20 ml de PBS pH 7,4 Éluer la protéine avec du PBS pH 7,4, 500 mM d'imidazole, goutte à goutte, tout en surveillant la bande de couleur sur la colonne Ni-NTA à réduire le volume de l'éluat. Dialyser l'éluat de 3 x à 10 mM NaPi pH 7,4 à une dilution de 1:2000 pendant 2 heures chacune. Utiliser une seringue stérile 0,45 um filtre pour filtrer l'éluat, aliquote de 5 x 100 pi des échantillons et congeler pression dans l'azote liquide. Le montant total des protéines doit être de 0,5 à 1 mg / ml dans chaque aliquote de 100 ul. option concentrtion étape Pour les injections stéréotaxiques rat, la protéine a été concentrée 10 fois dans un speed-vac (Concentrateur Eppendorf 5301). L'état tampon final était de 100 NaPi mM. α-synucléine étiquetage Le marquage et de purification (colonne Ni-NTA) de la α-synucléine recombinante a été réalisée en parallèle à DISC1 (598-785). Le total du matériau de départ était 500 pg au lieu de 1 mg pour DISC1 (598-785). 6. Traitement des bénéficiaires cellules SH-SY5Y avec marqué DISC1 recombinant (598-785) Protéine Semences 5×10 4 bénéficiaires SH-SY5Y cellules de neuroblastome humain exprimant de manière constitutive la GFP-DISC1 (598-854) sur des lamelles de verre stériles dans chaque puits d'une plaque à 24 puits. Ajouter protéine marquée au milieu de culture cellulaire à une concentration de 5-10 pg / ml et incuber pendant 48-72 h. Laver les cellules avec du PBS 3 x pH 7,4 et étancher extractionfluorescence ellular avec 0,04% bleu trypan pendant 5 min. Fixer les cellules avec 4% de PFA dans du PBS pH 7,4 pendant 10 min sur la glace, laver une fois avec H 2 O stérile et monter les lamelles sur des lames de verre avec ProLong or avec DAPI milieu de montage (Invitrogen, USA). Confirmer l'adoption / l'invasion de manière exogène appliquée protéine recombinante par colocalisation avec des protéines exprimées par des cellules recrutées bénéficiaires à Z-stack images générées par microscopie confocale à balayage laser. Pourtant, le recrutement de protéine endogène peut pas être détectée essentiellement en parallèle avec l'invasion de protéine de cellule hôte, Z-stack images peut encore confirmer le caractère invasif de la protéine. Dans notre exemple, rec. DISC1 (598-785) * au moins en partie soluble recrues GFP-étiqueté DISC1 (598-854) protéine exprimée par la cellule hôte (voir figure 5A). Pour recombinant invasion α-synucléine, mais aucun recrutement est montré (figure 5B). Les photos ont été prisessur un Zeiss LSM 510 confocal Zeiss ou un microscope AxioVision Apotome2. L'injection du concentré (environ 4 pi de 2,5 pg / pl), étiqueté DISC1 (598-785) * dans les résultats Mpfc dans la diffusion de la protéine autour du site d'injection qui peut être détecté même après la perfusion de l'animal avec 4% dans du PBS pH 7,4 PFA avec un filterset rhodamine. Dans notre exemple DISC1 (598-785) est repris par un nombre distinct de neurones et peut être contrôlé avec Z-stack d'imagerie (figure 6). En général, l'injection de protéines autres que celles utilisées ici ne conduisent pas nécessairement à la cellule-invasion. L'événement invasion dépend essentiellement de la nature de la protéine néanmoins une purification propre est une condition préalable à une analyse plus approfondie. 7. Les résultats représentatifs Aggresomes consistant recombinant FL DISC1-eGFP purifiée à partir de cellules du FLN a envahi destinataire SH-SY5Y CElls à faible rendement (environ 0,3% 5) comme on le voit par la colocalisation en microscopie confocale (figure 3). Comme indiqué précédemment, DISC1 (598-785) exprimée et purifiée à partir de E. coli formée multimères 4 sont également des cellules invasives dans un rendement d'environ 20% 5 (figure 5A) similaire à celui de α-synucléine qui a été utilisé en parallèle comme contrôle positif (figure 5B). Étiquetés DISC1 recombinant (598-785) exprimée et purifiée à partir de E. coli a également été cellulaire invasive pour les neurones in vivo lorsque la protéine multimérique a été stéréotaxique injecté dans le cortex médial préfrontal de rat (figure 6; Pum, Bader, Huston, Korth, non publié). Figure 1. Cellules de neuroblastome FNL exprimant de manière transitoire FP-DISC1 (rouge). Red aggresomes fluorescents peuvent être detela Direction exécutive dans les cellules. Figure 2. Purifiée mRFP-marqué DISC1 aggresomes après la purification dans un gradient de saccharose. Figure 3. Fluorescent image de aggresomes envahies. mRFP-étiquette flDISC1 aggresomes ont été purifiées et incubées avec des cellules de neuroblastome SH-SY5Y surexprimant GFP soluble étiquetée DISC1 (598-854). Un apport de aggresomes étiquetés est contrôlée par Z-stack imagerie sur un microscope à balayage laser (Zeiss LSM 510). Figure 4. SEC profil de rec. DISC1 (598-785) contenant le S704 et C704 les polymorphismes nucléotidiques simples (SNP). Les deux variantes montrent une perturbation d'oligomérisation commandé et la formation de mult haut poids moléculaireIMERS (flèche rouge). Cette image est modifié à partir de la publication de Leliveld et al., Biochemistry 2009. Figure 5. Fluorescent Z-stack image de DyLight marqué invasive DISC1 recombinant (598-785). Les cellules de neuroblastome SH-SY5Y exprimant la GFP-DISC1 soluble (598-854) ont été incubées avec étiquette, la protéine recombinante à une concentration de 5 pg / ml. (A) des agrégats Rouge montre l'invasion de rec. DISC1 (598-785) des protéines et des points jaunes indiquent un recrutement de GFP-DISC1 soluble (598-854) en agrégats. (B) recombinante α-synucléine (rouge) envahit les cellules sans recrutement avec une fréquence d'environ 20%. Cliquez ici pour agrandir la figure . Figure 6. Image immunofluorescence del'injection marqué, DISC1 recombinant (598-785) de protéine. Z-stack imagerie confirme la présence de rec. DISC1 (598-785) des protéines dans les neurones corticaux de rat tachés avec un anticorps contre les noyaux des neurones (NeuN, vert).