Generation, Zuivering en karakterisering van Cell-invasieve DISC1 Protein Soorten

1. Bereiding van aggresoom donorcellen: Transfectie van Monomeer Red Fluorescent Protein (mRFP) of versterkt groen fluorescent eiwit (EGFP)-gelabeld Human volledige lengte (FL) DISC1 Zaad 1,5 x 10 6/10 cm schotel menselijke neuroblastoom NLF (NLF; Children's Hospital van Philadelphia, Philadelphia, PA) cellen in tien schalen van 10 cm en groeien 's nachts. NLF cellen worden gekweekt in RPMI-1640 medium aangevuld met 10% FBS, penicilline / Strepomycin, L-Glutamine. De volgende dag moeten cellen bij 70-80% confluentie. Tijdelijk transfecteren elk 10 cm schaal met 15 ug plasmide-DNA en Metafectene transfectiereagens (Biontex, Martinsried, Duitsland). Kortom voor een 10 cm schaal, werd 15 ug plasmide-DNA en 30 pl Metafectene aan 750 pl Opti-MEM, gemengd en geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. 5 schalen werden getransfecteerd met pcDNA3.1 mRFP / eGFP-gelabeld humaan (FL) DISC1 en 5 schotels met eGFP-plasmide alleen. 2. AggresoomZuivering van getransfecteerde cellen Donor De hier beschreven protocol is een combinatie van een methode om Lewy-lichamen zuiveren van hersenweefsel 13 en een protocol om grote aggregaten en aggresomes 14 isoleren. Omdat bestaande methoden berusten op het gebruik van detergentia, de isolatie van detergens vrij proteïne voor toepassing in cel-assays invasiviteit is kritisch. 48 uur na transfectie, bewaken de expressie van eGFP en mRFP/eGFP-DISC1 en bevestigen de vorming van aggresomes onder een fluorescentiemicroscoop (figuur 1). Spoel de cellen met PBS pH 7,4, schrapen met 400 pi PBS per Voeg 1X Protease Inhibitor Cocktail (Roche, Indianapolis, IN) en verstoren de cellen door een Precellys24 homogenisator (Bertin technologieën, Frankrijk). In het kort, voeg 1 ml celsuspensie op een 2 ml lysis buis en voeg 10 keramiek kralen. Lyse van de cellen met 3 x 60 sec pulsen. De mechanische kracht van het proces kanverhogen van de temperatuur in het monster boven 37 ° C, zodat voorzichtigheid is geboden aan het monster koelen op ijs na lysis procedure. Koel de cellen op ijs en voeg 10 mM MgCl2, 40 U / ml DNase A en incubeer 60 min bij 37 ° C Bereid oplossingen van 80%, 50%, 20% sucrose (w / v) in PBS pH 7,4 (10 ml elk). Bereid de sucrose gradiënt in een 15 ml falcon-buis, te beginnen met 2 ml 80% sucrose, gevolgd door 50% en 20%. Giet langzaam de helling en wees voorzichtig dat u reeds gegoten lagen te verstoren. Laag de verkregen lysaat bovenop de gradiënt en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 1000 xg bij 4 ° C. Zorgvuldig verzamelen interface tussen de 50-80% sucrose laag met een pipet en meng met 5 volumina PBS pH 7,4. Centrifugeer gedurende 15 min bij 1000 xg bij 4 ° C. Herhaal het wassen van twee extra keer. In deze interfase, aggresomes zijn fluorescerend en kunnen worden gevisualiseerd in een microscoop onder UV-licht. Verwijder het supernatant enresuspendeer de pellet op 250-500 ul PBS pH 7,4. Deze pellet bevat het gezuiverde aggresomes (figuur 2). 3. Behandeling van Ontvanger SH-SY5Y Cellen met mRFP/eGFP-DISC1 Aggresomes Zaad 5 x 10 4 ontvanger SH-SY5Y menselijke neuroblastoomcellen constitutief tot expressie GFP-DISC1 (598-854) op steriele dekglaasjes in elk putje van een plaat met 24 putjes. SH-SY5Y cellen worden gekweekt in DMEM/F-12 medium aangevuld met penicilline / streptomycine, niet-essentiële aminozuren (NEAA) en 10% FBS. 24 uur later, wordt 10 pi aan elk putje en incubeer gedurende 48-72 uur. Spoel de cellen met 3 x PBS pH 7,4 en doof extracellulaire fluorescentie met 0,04% Trypan Blue gedurende 5 minuten. Bevestig de cellen met 4% PFA in PBS pH 7,4 gedurende 10 min op ijs, eenmaal wassen met steriel H2O en monteren dekglaasjes op glasplaatjes met ProLong Gold met DAPI fixeermiddel (Invitrogen, USA). Bevestig de opname /invasie van exogeen toegepaste aggresomes door colokalisatie met aangeworven eiwitten die door ontvangende cellen in Z-stack beelden. Toch kan opname / invasie van exogeen eiwit niet wezenlijk worden gedetecteerd in parallel met rekrutering gastheercel eiwit. In ons voorbeeld mRFP gemerkte DISC1 aggresomes werven oplosbaar GFP-gelabeld DISC1 (598-854) proteïne uitgedrukt door de gastheercel (zie figuur 3). Foto's werden genomen op een Zeiss LSM 510 confocale-of een Zeiss AxioVision Apotome2 Microscoop. 4. Generatie van recombinant DISC1 (598 tot 785) In een eerdere publicatie analyseerden we het vermogen van diverse DISC1 eiwitfragmenten om zelf interactie gebaseerd op de aanwezigheid van zelfassociatie domeinen. Van alle geteste menselijke eiwitfragmenten DISC1 (598-785) weergegeven sterkste multimerisatie propensity 4 (Figuur 4). Daarom werd de menselijke DISC1 (598-785) gekloneerd in pET15b (nr.vagen, Madison, Wisconsin) die een N-terminale 6-histidine tag, uitgedrukt in E. coli BL21-(lDE3) Rosetta (Novagen, VS) en gezuiverd onder denaturerende omstandigheden in 8 mol / l ureum zoals beschreven 4. In het kort, is het protocol hieronder beschreven. BL21-(ide3) Rosetta E. coli werden gekweekt in 2 x 500 ml 2YT dat 5 mM-arginine-HCl, 5 mM MgSO4, 100 ug / ml carbencillin, 35 ug / ml chlooramfenicol tot een OD 600: 0,6-0,8 en DISC1 (598-785) expressie werd geïnduceerd met 1 mM IPTG. DISC1 (598-785) werd uitgedrukt gedurende 4 uur bij 37 ° C werd de expressie beëindigd door het oogsten van de bacteriën door centrifugatie. De bacteriële pellet werd geresuspendeerd in 50 ml TE buffer (50 mM TRIS-HCl pH 8,0, 5 mM EDTA) plus 2 mM PMSF, 1% TX-100, 250 ug / ml lysozym, 20 mM MgCl2 en 400 ml U/50 DNase I. Om volledige lysis te verzekeren, werd het reactiemengsel gedurende 30 min bij kamertemperatuur onder voorzichtig roeren. Voeg 10 mM β-mercaptoethanol (ME) en 500 mM NaCl en incubeer 30 min een. Spin down bacteriële insluitlichaampjes op 20.000 g gedurende 30 min bij 4 ° C. Hersuspendeer pellet in 50 ml extractiebuffer bevattende 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM imidazool, 500 mM NaCl, 8 M ureum en 10 mM β-ME en verwijder afval door centrifugatie bij 20.000 g gedurende 30 min bij 4 ° C. Was de Ni-NTA agarose matrix met extractiebuffer. Incubeer de geresuspendeerde, vooraf geklaard eiwitextract met Ni-NTA matrix gedurende 2 uur bij KT. Was de Ni-NTA matrix met extractiebuffer bevattende 12 mM imidazool. Langzaam Elueer het eiwit met 15 ml elutiebuffer die 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM imidazool, 8 M ureum, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA en 10 mM β-ME. Dialyseer het eiwit stapsgewijs te PBS pH 7,4 bevattende 10 mM β-ME. Vanaf 1 L bacteriële starten cultuur is het mogelijk om tot isoleren tot 50 mg recombinant DISC1 (598 tot 785) protein. α-synucleïne hervouwing Voor experimenten met α-synucleïne, 500 ug van het recombinante eiwit (Sigma-Aldrich, USA) werd opgelost in PBS bij een concentratie van 1 mg / ml. Oligomeren verkrijgen hervouwing werd gedurende de nacht bij 37 ° C zoals beschreven in een eerdere publicatie 10. 5. Etikettering van Recombinant DISC1 (598 tot 785) met DyLight594 Voorafgaand het naderhand coderen proces, DISC1 (598 tot 785) eiwit is het bevrijd worden van β-ME. Derhalve wordt het eiwit gedialyseerd 3 keer met PBS pH 7,4 bij een verdunning van 1:2000. Label 1 mg DISC1 (598-785) met DyLight 594 maleïmide (Thermo Scientific, USA) volgens de instructies van de fabrikant. Kortom, los 1 mg / ml eiwit in PBS pH 7,4 en voeg 5 mM TCEP om vrije thiolgroepen te herstellen. Voeg 20 ul van de DMF opgeloste kleurstof aan de reactie en incubeer gedurende 2 uur bij KT. Dialyseer het eiwit tot 3 x PBS pH7,4 bij een verhouding van 1:2000 voor 2 uur elk. Verdere verhoging van de zuiverheid van het gelabelde eiwit een His6-tag based affiniteit-zuivering op een Ni-NTA kolom uitgevoerd. Wash 1 ml Ni-NTA matrix (Qiagen, Duitsland) met 10 ml PBS pH 7,4. Breng de gelabelde, gedialyseerd eiwit aan de kolom en laat hem langzaam lopen over de kolom. Was het eiwit met 3 x 20 ml PBS pH 7,4 Elueer het eiwit met PBS pH 7,4, 500 mM imidazool druppelsgewijze onder controle van de gekleurde band op de Ni-NTA kolom het eluaat volume te verlagen. Dialyseer het eluaat 3 x met 10 mM NaPi pH 7,4 bij een verdunning van 1:2000 gedurende 2 uur elk. Een steriele 0,45 urn spuitfilter het eluaat aliquot in 5 x 100 ul monsters en snap bevriezen in vloeibare stikstof filteren. De totale hoeveelheid eiwit moet 0,5 – 1 ug / ml per 100 ul aliquot. optionele concentratie stap Voor stereotactical rat injecties werd het eiwit 10-voudig geconcentreerd in een Speed-Vac (Eppendorf Concentrator 5301). De laatste buffer voorwaarde was 100 mM NaPi. α-synucleïne Labeling De labeling en zuivering (Ni-NTA kolom) van de recombinant α-synucleïne werd uitgevoerd parallel aan DISC1 (598-785). Het totale uitgangsmateriaal was 500 ug plaats van 1 mg DISC1 (598-785). 6. Behandeling van Ontvanger SH-SY5Y Cellen met gemerkt recombinant DISC1 (598 tot 785) Protein Seed 5×10 4 Ontvanger SH-SY5Y menselijke neuroblastoomcellen constitutief tot expressie GFP-DISC1 (598-854) op steriele dekglaasjes in elk putje van een plaat met 24 putjes. Toevoegen gemerkt eiwit aan het celkweekmedium in een concentratie van 5-10 ug / ml en incubeer gedurende 48-72 uur. Was de cellen 3 x met PBS pH 7,4 en lessen extractieellular fluorescentie met 0,04% Trypan Blue gedurende 5 minuten. Bevestig de cellen met 4% PFA in PBS pH 7,4 gedurende 10 min op ijs, eenmaal wassen met steriel H2O en monteren dekglaasjes op glasplaatjes met ProLong Gold met DAPI fixeermiddel (Invitrogen, USA). Bevestig de opname / invasie van exogeen toegepaste recombinant eiwit door colokalisatie met aangeworven eiwitten die door ontvangende cellen in Z-stack beelden gegenereerd door laser scanning confocale microscopie. Toch werving van endogeen eiwit niet kan worden gedetecteerd in hoofdzaak parallel met invasie van gastheercel eiwit, kan Z-stack beelden nog bevestigen het invasieve karakter van het eiwit. In ons voorbeeld rec. DISC1 (598-785) * tenminste gedeeltelijk oplosbaar rekruten GFP-gelabeld DISC1 (598-854) proteïne uitgedrukt door de gastheercel (zie figuur 5A). Voor recombinant α-synucleïne invasie maar geen rekrutering (Figuur 5B). Foto's zijn genomeneen Zeiss LSM 510 confocale-of een Zeiss microscoop AxioVision Apotome2. De injectie van de geconcentreerde (ca. 4 pl van 2,5 ug / ul), gelabeld DISC1 (598-785) * in de mPFC leidt tot het verspreiden van het eiwit rond de injectieplaats die zelfs na perfusie van de dieren worden gedetecteerd met 4% PFA in PBS pH 7,4 met een rhodamine filterset. In ons voorbeeld DISC1 (598-785) wordt opgenomen door een afzonderlijk aantal neuronen en kunnen door Z-stack imaging (Figuur 6). In het algemeen hebben de injectie van eiwitten anders dan die welke worden gebruikt hier niet te leiden tot cel-invasie. De invasie event is voornamelijk afhankelijk van de aard van het eiwit toch een schone zuivering is een voorwaarde voor verdere analyse. 7. Representatieve resultaten Aggresomes bestaande uit recombinant FL DISC1-eGFP gezuiverd van NLF cellen binnengevallen ontvanger SH-SY5Y ceLLS bij lage efficiëntie (ongeveer 0,3% 5) zoals zichtbaar colokalisatie met confocale microscopie (figuur 3). Zoals eerder gemeld, DISC1 (598-785) uitgedrukt en gezuiverd uit E. coli gevormd multimeren 4 waren even cell-invasieve bij een rendement van ongeveer 20% 5 (Figuur 5A) gelijk aan die van α-synucleïne dat in parallel als positieve controle (Figuur 5B). Gelabeld recombinant DISC1 (598-785) uitgedrukt en gezuiverd uit E. coli was ook cel-invasieve aan neuronen in vivo wanneer het multimere eiwit stereotactisch geïnjecteerd in de mediale prefrontale cortex van de rat (figuur 6; Pum, Bader, Huston, Korth, ongepubliceerd). Figuur 1. NLF neuroblastomacellen transiënt tot expressie FP-DISC1 (rood). Rode fluorescerende aggresomes kan verslechteringcted in de cellen. Figuur 2. Gezuiverd mRFP gemerkte DISC1 aggresomes na zuivering in een sucrosegradiënt. Figuur 3. Fluorescentie beeld van binnengevallen aggresomes. mRFP-gelabeld flDISC1 aggresomes werden gezuiverd en geïncubeerd met SH-SY5Y neuroblastoomcellen overexpressie oplosbaar GFP-gelabeld DISC1 (598-854). Een opname van gelabelde aggresomes wordt bewaakt door Z-stack beeldvorming op een Laser-Scan microscoop (Zeiss LSM 510). Figuur 4. SEC-profiel van rec. DISC1 (598 tot 785) met de S704 en de C704 single nucleotide polymorfismen (SNP). Beide varianten tonen een verstoring van geordende oligomerisatie en vorming van hoog molecuulgewicht multimers (rode pijl). Dit beeld wordt aangepast na de publicatie van Leliveld et al.., Biochemistry 2009. Figuur 5. Fluorescent Z-stack beeld van invasieve DyLight-gelabeld recombinant DISC1 (598 tot 785). SH-SY5Y neuroblastoomcellen expressie oplosbaar GFP-DISC1 (598-854) werden geïncubeerd met gemerkt, recombinant eiwit in een concentratie van 5 ug / ml. (A) Red aggregaten toont de invasie van rec. DISC1 (598 tot 785) eiwit en gele stippen geven een werving van oplosbare GFP-DISC1 (598 tot 854) in aggregaten. (B) Recombinant α-synucleïne (rood) binnendringt de cellen zonder recruitment met een frequentie van ongeveer 20%. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken . Figuur 6. Immunofluorescente beeld vande geïnjecteerde gelabelde recombinant DISC1 (598-785) eiwit. Z-stack beeldvorming bevestigt de aanwezigheid van rec. DISC1 (598-785) eiwit in rat corticale neuronen gekleurd met een antilichaam tegen neuronale kernen (neun, groen).