İzole Biventriküler ve NADH Floresans Görüntüleme Tavşan Kalpler Çalışma

1. Çalışma için Ayarlama 118 NaCl, 3.30 KCl, 2.00 CaCl2, 1.20 MgSO 4, 24,0 NaHCO 3, 1,20 KH 2 PO 4, 10,0 glukoz, 2.00 NaPyruvate ve 20.0 mg / L albümin: modifiye Krebs-Henseleit solüsyonu 16 dört litre (mM hazırlayın ). Çözeltisi mümkün olduğunca deney başlamadan yakın olarak hazırlanır. PH steril filtreleme (: 22 mikron, Corning gözenek boyutu) sonra 7.4 'e ayarlanmalıdır. Çözüm osmolalitesi 275 ve 295 mOsm / kg arasında olmalıdır. Arıtılmış su ile çalışan kalp sisteminin tüm tüpler ve odaları durulayın. Tüm su sistemi kaldırıldı kadar pompaları çalıştırın. Perfüzyon pompaları (Langendorff perfüzyon pompa, sol kalp perfüzyon pompası ve sağ kalp perfüzyon pompası) her doğrultusunda: selüloz membran filtre (5 mikron, Advantec gözenek boyutu) ekleyin. Her basınç sensörü için iki noktalı kalibrasyon (0 ve 60 mmHg) gerçekleştirin. Su banyoları açın. A ısıtmalı döner su banyosunda (Cole Palmer) su ceketli tüpler ve ısı değiştiriciler ısıtmak için kullanılır. Perfüzat ayrı bir su banyosunda (Oakton Instruments) önceden ısıtılır. Her iki hamam 37 ° C bir çözelti sıcaklığı korumak için ayarlanır Kapalı bir döngü içinde perfüzat dolaşmaya pompalar açın. Perfüzat 80 kPa'dan az% 95 O 2 ve% 5 CO2 ile gazlandırılan microfiber oxygenators (hemofilters) geçer. Oksijenli perfüzat ardından kalp kanüller girmeden önce 37 ° C arasında bir sıcaklıkta bunu korumak için ısı değiştirici aracılığıyla akar. 2. Kalp Eksizyon Sabit basınç Langendorff modunda çalıştırmak için çalışan kalp sistemini ayarlayarak başlayın. 50-60 mm Hg aralığında aortik bloğun basınç ayarlanır. Ketamin (44 mg / Kg) ve ksilazin (10 mg / Kg) intramüsküler enjeksiyonu ile tavşan uyutmak. Tavşan (, uyuşturulmuş pentobarbital sonra 50 mg / Kg) ve heparin (2000 U) intravenöz arka bacak iç kısmında marjinal kulak ven veya yanal safen ven yoluyla enjekte edilir. Tavşan tamamen sigara duyarlı olduğunda, ağrı refleksi eksikliği ile belirlenen, göğüs boşluğu hızla açıldı, perikard dilimlenmiş, aort kenetlenir ve kalp ve akciğerler eksize edilir. Bu noktada akciğerlerin pulmoner venlerin izole yardımcı olmak için kalp takılı kalmış olmalıdır. 60 mL perfüzat ve heparinin 200 birimleri ile doldurulmuş bir şırınga bağlı bir 5 mm çaplı kanül ile aorta izole etmek ve kanüle. Boyut sıfır ipek sütür ile kanül ile aorta sabitleyin ve yavaşça kan kalbi temizlemek için şırınga bastırın. 3. Biventriküler kanülasyonu Çalışan kalp sisteminin aort bloğuna kalp bağlayın. Koroner emboliye neden olabilir aorta, giren hava önleyin. Bu aort bl için kanül eklemek en iyisidireğik bir açı ile aort bağlayıcı yaklaşırken ve takılı iken perfüzat yavaşça kanül içine bağlayıcı ile damla izin vererek ock. Kalp sabit basınç Langendorff modunda perfüze edilirken, yağ ve bağ dokusu kaldırmak ve aşağıdaki gemileri bulun: inferior ve superior vena kava, azygos ven, pulmoner arter, pulmoner venler. Superior vena kava Ligate. Sadece aşağıdaki pulmoner arter Kes sağ ve sol pulmoner arterler için nerede dalları. Grup kalp ve akciğerler ve bir sütür kullanarak hepsini ligate arasında kalan tüm damarları (pulmoner venler). Akciğerleri çıkarın. Sol atriyal apendiks köşesinde küçük bir delik kesin. LA perfüzat ile dolu olduğundan emin olun. Eklemeden ise tamamen perfüzat kanül ile doldurulmuş olduğu sağlarken LA kanüle. Apendiks için kanül dikin. T akışını sağlamak için sol taraftaki pompa (pompa # 2) açınO sol atriyum. 6 mmHg ve ayarlamak ± 2 mmHg olarak atriyal dilatasyon tarafından belirlenir – 2 arasındaki preload basıncı ayarlayın. Langendorff pompası (pompa # 1) kapatarak çalışma kalp moduna kalp geçin. An 10 mmHg aort basıncını düşürmek ve sonra yavaş yavaş 80-100 mmHg aralığı içinde, bu artar. Bu aort kapağı açın ve normal fizyolojik koşullar sırasında olduğu gibi çalışması için izin verecektir. Nihai afterload basıncı LV kontraktilite bağlıdır. Bu tepe LV basıncı yaklaşık 20 mmHg daha az bir değere ayarlanması gerekir. LV kardiyak çıktı aortik blok (ml / dakika) çıkmadan perfüzat akış hızı ölçülmesiyle belirlenebilir. Normal kardiyak output ise 14.77 ila 16.43 ml / 100 vücut ağırlığı 17 g ve ortalama başına en az 340 mL / 2.2 kg tavşan için min. Aortik basınç Şekil 1'de gösterildiği gibi basınçlı sinyali benzer. I ile RA kanülenferior vena kava. RA ve kanül hem de tamamen perfüzat ile doldurulması sağlanır ve hava kabarcığı oluşumunu önlerken kanül yerleştirin. Vene kanül dikin. Sağ atriyuma akışını sağlamak için sağ tarafında pompa (pompa # 3) açın. Yaklaşık 3 mmHg basınç ayarlayın. RV perfüzat ile dolu olduğundan emin olun ve pulmoner arter kanüle. Bu hava kabarcıklarını engellemek için takılıyken kanül tamamen perfüzat ile dolu olduğundan emin olun. Pulmoner arter kanülü dikin. 4. Sinyal Toplama: Baskılar, Monofazik Aksiyon Potansiyelinin ve fNADH Biventriküler kanülasyon tamamlandıktan sonra, dikkatle aort kanülasyonu ile aorta basınç dönüştürücü kateter (Millar) yerleştirin. Yavaşça aort kapak geçmiş ve LV içine gidin. Kateter ucu uygun pozisyonun sağlanması için LV basınç sinyali izleyin. LV basınçlı bir örneği gösterilmiştirŞekil 1 'de. Yavaşça ventriküler epikarda karşı monofazik aksiyon potansiyeli elektrot basın. Uygun aksiyon potansiyeli ölçümleri elde etmek sinyali izleyin. Sinyal hafif hareket artefaktı normaldir. Kalp adımlamak için sağ atrium bir bipolar uyaran elektrot yerleştirin. Bizim protokolde, kupa sırasıyla 200 ve 400 bpm karşılık gelen 300 ve 150 milisaniye arasında döngü uzunlukları, az tempolu idi. LV epikardiyal yüzeyi sıcaklığını ölçün. Çalışma sıcaklığı 37 tutulur gerektiriyorsa ° C daha sonra bir su-ceketli kalp boşluklarında veya batığın kalp boyunca sabit sıcaklık korumak için ısıtılmış superfusate banyosunda kalp içinde kalp yerleştirin. CCD kamera (Andor iXon DV860, 128×128 piksel) yerleştirin ve görünümü uygun bir alan olduğu gözlendi Lens odak. Kamera bir iş istasyonu bağlı ve görüntüleri Andor Solis softwa kullanarak 2 fps elde edilenyeniden. Önceden görüntüleme başlamasından cıva lambası ışığı açın. Işık kalbin yüzeyine aydınlatmak için bir harekete geçirici filtre (350 ± 25 nm, Chroma Teknolojisi) aracılığıyla ve bir fiber optik ışık kılavuzu (Horiba Jobin Yvon modeli 1950 1M) içine yönlendirilir. Işık kılavuzu ile UV ışık zayıflatma küçüktür. UV aydınlatma ayrıca LED spot oluşan yüksek güçlü LED sistemi (Mightex PLS-0365-030-S) ve bir kontrol ünitesi (Mightex SLC-SA04-ABD) kullanılarak sağlanabilir. Oda ışığı kapatın ve herhangi bir ortam aydınlatması en aza indirmek. Üniforma epikardiyal aydınlatma elde etmek için kalbi ışık kılavuzu (veya LED spot) ve yüksükler yöneltin. Yayılan NADH floresans (fNADH) bir emisyon filtresi (460 ± 20 nm Chroma Teknolojisi) geçer ve CCD kamera ile görüntülenmektedir. Görüntüleme yazılımı kullanılarak ilgilenilen bölge seçerek zamanla fNADH değişiklikleri izleyin. Bölgede o içinde ortalama piksel yoğunluğu izlemek için canlı-güncellemek modunu seçinf faiz. Kalp uygun baskılar oluşturmak için biventriküler çalışma modunda çalıştığında edilmelidir. fNADH seviyesinin yeterli koroner perfüzyon onaylamak için epikardiyal yüzeyi üzerinde düşük ve istikrarlı olmalıdır. Çalışmada bu noktada belirli bir deney protokolünde bir hipotezi test etmek için uygulanmalıdır. Çalışma tamamlandıktan sonra, sistem kalp kaldırmak ve tüm tahliye perfüzat. Arıtılmış su ile sistem tüp ve odaları durulayın. Rutin bakım için, sistem periyodik Mucasol çözüm veya gerektiği gibi bir seyreltilmiş hidrojen peroksit çözeltisi ile durulanmalıdır. 5.. FNADH Görüntüler off-line İşleme NADH veri setleri karşılaştırmak için bir yolu (fNADH (i, j, t)) deneyleri arasında bir referans görüntü kullanılarak her floresan görüntü normalleştirmek için aşağıdaki denklemde gösterilen dataset 9 (fNADH (i, j, t 0)), . NADH floresans normalleştirmek için başka bir yolu pl etmektirace deney 9, 18, ​​19 öncesi görüş alanında uranil cam küçük bir parça. Stabil bir referans olarak kullanılmak üzere bir sinyal sağlamak için UV ışığı uygulanır – uranil cam olacak floresans (550 nm 450). 6. Temsilcisi Sonuçlar Bir biventriküler kalp çalışma tavşan hazırlanması ön ve bazal kez Şekil 1 'de gösterilmiştir. Sol ventrikül basıncı aort kapak geçmiş ve sol ventrikül içine bir basınç dönüştürücü kateter (Millar SPR-407) gezinme tarafından ölçüldü. Aort, pulmoner arter ve sol ventrikül basınçları (LVP) Şekil 1C gösterilmiştir. Diyastolik LVP genelde 0 ile 10 mmHg. Minimum diyastolik aort basıncı yaklaşık 60 mmHg. Pik sistolik LVP dolum basıncı (preload veya LA basıncı) ve kontraktilite bağlıdırve, en iyi, 80 ve 100 mmHg arasında olmalıdır. Şekil 1C gösterildiği gibi maksimum aort basınç ve maksimum LVP yakından eşleşmesi gerekir. Tavşan kalp için tipik olan hızlı depolarizasyonu faz ve bir repolarizasyon fazı ile aksiyon potansiyeli (MAP) Şekil 1B 'de gösterilmiştir. Şekil 1D gösterildiği gibi MAP'ler, bir müteahhitlik kalpten nispeten kolayca kaydedilebilir ancak genellikle diyastolde küçük hareket artifakı olacaktır. MAP uyarım esnasında kalp (yakalama) başarılı sürüklenmesini doğrulanması için yararlı olan ve aynı zamanda diğer akut iskemi ya da bağlı düzensizlikler, yerel elektrofizyolojik değişiklikleri ölçmek için kullanılabilir. EKG de sıcak superfusate bir banyoda kalp batırma ve kalbin sol ve sağ tarafında banyosunda bir elektrot yerleştirerek ölçülebilir. Üçüncü bir kayıtsız elektrot ya uzağa kalpten, banyosuna yerleştirilir veya aorta eklenir.Bir EKG genel elektrik fonksiyonu değerlendirmek için ve iskemi varlığının ortaya çıkarılması için yararlıdır küresel uyarma ve repolarizasyon sürecinin, hakkında bilgi sağlayacaktır. fNADH görüntüleme iskemik ya hipoksik bölgelerin zamanmekansal ilerlemesini ölçmek için kullanılabilir kalp mitokondriyal redoks değişiklikler ortaya çıkarmaktadır. Bu çalışma için, epikardiyal fNADH döngüsü 300 uzunlukları (CL), 200 ve 150 milisaniye az üç pacing hızları sırasında redoks durumundaki değişiklikleri izlemek için ölçüldü. Bir ilgi bölgesi (kırmızı kutu, Şekil 2) Ortalama fNADH değerleri siklus uzunluğu kısalır gibi temel fNADH düzeylerini artırmak olduğunu göstermektedir. Hızı pacing bazal fNADH seviyesi nispeten sabit sinüs ritmi (CL = 300 milisaniye) yakındır. Siklus uzunluğu en kısa CL (150 ms) de büyük artış ile 300 milisaniye, bazal fNADH düzeylerinin artışı, altında kısaltılmış olarak. Tam ön yüzeyinin yüksek çözünürlüklü görüntüleme fNADH200 ve 400 dak Şekil 3 'de gösterilmiştir. 200 bpm ile fNADH düzeyleri sabit ve mekansal homojen idi. 400 bpm, fNADH seviyeleri epikarda boyunca önemli ölçüde artmıştır. Önemli mekansal heterojenite RV ve LV septal bölgeleri içinde meydana gelen büyük artışlar gözlenmiştir. FNADH sinyal kasılması (hareket artefakt) ile salınım ve salınım frekansı kalp atım hızı (Şekil 2) karşılık gelir. Biventriküler kanülasyon ise, kalbin kasılması sırasında tabanı sallanan gelen kalp engellemeye yardımcı olur 4 kanüller, tarafından düzenleniyor. Bu nedenle, titreşim genliği artık zaman ölçeği (5-10 sn) iskemi veya hipoksi kaynaklanır fNADH eğilimleri daima daha azdır. Şekil 1.. Izole bir biventriküler tipik bir baskı ve aksiyon potansiyeli ra çalışmabbit kalp. Dört kanüller gösteren kalp A. Bazal görünümü:; 2, pulmoner arter; 1, aort sağ atriyal ve 4 B. sol ventrikül (LV) gösteren kalbin ön görünümü ve sağ ventrikül, 3, atriyal bıraktı. (RV). C. Temsilcisi baskılar. Top: sol ventrikül basıncı (düz çizgi) ve aort basıncı (noktalı çizgi). Alt:. Pulmoner basınç D. Örnek aksiyon potansiyeli. Sinyal paneli C'de gösterildiği baskıları ile aynı hizaya büyük rakam görmek için buraya tıklayın . Şekil 2. tavşan kalp çalışan izole biventriküler ve fNADH görüntüleme. Top: görünümü (solda) ve üç fNADH görüntü alan bir karikatür gösterilmiştir. İlgili Pacing döngüsü uzunluğu (CL) her bir görüntü gösterilir.Alt panelinde fNADH sinyali için ilgi bölgesi kırmızı kutu ile gösterilir. Monofazik aksiyon potansiyeli elektrot ucu ilgi bölgenin sağında görülür. Epikarda Şekil 5 'de gösterildiği gibi, civa ve lambanın ışık kılavuz kullanılarak aydınlatılır edildi. Sadece ilgi bölgenin çevresindeki epikardiyal yüzeyi aydınlattı Alt:. Ilgi bölge için ortalama fNADH üst panelinde kırmızı kutu ile gösterilir. Azalan döngü süresini ortalama fNADH artar. Şekil 3. tavşan kalp çalışma izole bir biventriküler tam ön yüzeyinin fNADH görüntüler. kalp 200 bpm ve 400 bpm ile RA gelen tempolu oldu. İki adet yüksek güçlü LED (Mightex PLS-0365-030-S, 365 nm,% 4 ile tüm ön epikarda aydınlatırken fNADH (2 fps, 0.4 mm çözünürlükte 128×128 piksel) görüntülendi intensity, 50 mW maks).