절연 Biventricular의 NADH 형광 이미징은 토끼 하트 워킹

1. 학습을위한 설정 118 NaCl, 3.30 KCl, 2.00 CaCl 2, 1.20 MgSO 4, 24.0 NaHCO 3, 1.20 KH 2 PO 4, 10.0 포도당, 2.00 NaPyruvate 및 20.0 MG / L 알부민 : 수정된 Krebs-Henseleit 솔루션 16 네 가지 리터 (㎜의 준비 ). 솔루션은 가능한 한 실험의 시작 근처로 준비되어야한다. 산도는 살균 필터링 (: 22 μm의, 코닝 기공 크기) 후 7.4로 조정해야합니다. 솔루션 osmolality는 275 및 295 mOsm / kg 사이 여야합니다. 물을 정화와 함께 일하는 마음이 시스템의 모든 튜브와 챔버를 씻어. 모든 물이 시스템에서 제거되었습니다 때까지 펌프를 실행합니다. 관류 펌프 (Langendorff 재관류 펌프, 왼쪽 심장 관류 펌프, 및 오른쪽 심장 관류 펌프)의 각과 일치 : 셀룰로스 멤브레인 필터 (5 μm의, Advantec 기공 크기) 추가합니다. 각 압력 센서에 대한 두 포인트 교정 (0와 60 mmHg) 수행합니다. 물이 욕조를 켭니다. 온수 순환 물 목욕 (콜 팔머가) 물 외피 튜브 및 열교환기을 따뜻하게하는 데 사용됩니다. Perfusate는 별도의 물을 욕조 (Oakton 인 스트 루먼트)에 미리 예열한다. 두 온천은 37 ° C의 용액 온도를 유지하기 위해 설정됩니다 폐쇄 루프에서 perfusate를 순환하기 위해 펌프를 켭니다. Perfusate 80 kPa에서 95% O 2 5 % CO 2 가스에 마이크로 화이버의 oxygenators (hemofilters)를 통해 전달합니다. 산소 perfusate 그러면 심장 캐뉼러에 들어가기 전에 37 ° C의 온도를 유지하기 위해 열교환기 흐르는. 2. 심장 절단 정압 Langendorff 모드에서 작동하는 일하는 심장 시스템을 설정하여 시작합니다. 50-60 mmHg의 범위 내에서 대동맥 블록의 압력을 설정합니다. 케타민을 (44 밀리그램 / kg)과 xylazine (10 밀리그램 / 킬로그램)의 근육내 주사로 토끼를 마취. 토끼 (진정제를 pentobarbital되면 50 밀리그램 / Kg)과 헤파린은 (2000 U) 정맥 내 뒷다리 안쪽에 한계 귀 정맥 또는 측면 saphenous 정맥을 통해 주입된다. 토끼가 완전히 무반응되면 같은 고통 반사의 부족에 의해 결정, 흉강 신속하게 열, 심장막가 슬라이스되어 대동맥이 채워되고, 심장과 폐가 excised됩니다. 이때 폐가 폐 혈관을 분리를 도와 심장에 붙어 남아 있어야합니다. 60 ML의 perfusate과 헤파린 200 단위로 가득 주사기에 연결된 5 밀리미터 직경 정맥과 대동맥 격리하고 cannulate. 사이즈 제로의 실크 봉합사로 정맥으로 대동맥을 고정하고 천천히 혈액의 심장을 내리려고 주사기를 우울하게. 3. Biventricular Cannulation 근무 심장 시스템의 대동맥 블록에 마음을 연결합니다. 관상 emboli가 발생할 수 있습니다 대동맥을 입력에서 공기를 방지. 그것은 대동맥 BL로 정맥을 첨부하는 것이 가장 좋습니다비스듬한 각도로 대동맥 커넥터에 접근하고 그것이 연결되어있는 동안 perfusate가 부드럽게 정맥으로 커넥터에서 드립함으로써 ock. 심장이 일정한 압력 Langendorff 모드에서 perfused되는 동안 지방과 결합 조직을 제거하고 다음과 같은 혈관 찾습니다 열등하고 우수한 대정 맥, azygos 정맥, 폐동맥, 폐동맥 혈관을. 우수한 대정 맥을 Ligate. 아래 폐동맥을 절단 오른쪽과 왼쪽 폐 동맥까지 어디 그것은 나뭇가지. 그룹 심장과 폐의 하나의 봉합사를 사용하여 그들을 모두 ligate 사이 나머지 혈관 (폐동맥 혈관). 폐를 제거합니다. 왼쪽 심방 부위요의 모서리에 작은 구멍을 잘라 버릴거야. 라이 perfusate 가득되었는지 확인하십시오. 그것이 삽입되는 동안 정맥이 완전히 perfusate으로 가득차있다는 확보하면서 LA를 Cannulate. 라 부위요으로 정맥을 봉합해. t에 흐름을 제공하기 위해 왼쪽 펌프 (펌프 # 2)를 켭니다그는 안마당을 떠났어. 6 mmHg 및 조정 ± 2 mmHg와 같은 심방 팽창에 의해 결정 – 2 사이에 미리 압력을 설정합니다. Langendorff 펌프 (펌프 # 1)을 해제하여 작업 심장 모드로 마음을 전환합니다. 순간적으로 10 mmHg로 대동맥 압력을 감소하고 서서히 80-100 mmHg의 범위 내에서 그것을 향상시킬 수 있습니다. 이것은 대동맥 밸브가 열리고 그것이 정상적인 physiologic 조건 중에처럼 작동할 수 있습니다. 최종 afterload 압력 LV의 수축성에 따라 다릅니다. 이것은 피크 LV 압력보다 약 20 mmHg 이하 값으로 설정되어야합니다. LV 심장 출력은 대동맥 블록 (ML / 분)를 종료 perfusate의 유량을 측정하여 결정하실 수 있습니다. 정상적인 심장 출력은 14.77 명에서 16.43 ML / 100 체중 17 g 및 평균 당 최소 340 ML / 2.2 kg의 토끼를위한 분. 대동맥 압력은 그림 1에 표시된 압력 신호 유사합니다. 제가 통해 RA를 Cannulatenferior 대정 맥. RA과 정맥 모두가 완전히 perfusate 채워져 있는지 확인하고 기포의 형성을 방지하면서 정맥을 삽입합니다. 정맥으로 정맥을 봉합해. 오른쪽 아트리움으로 흐름을 제공하기 위해 오른쪽 펌프 (펌프 # 3)를 켭니다. 약 3 mmHg까지 압력을 설정합니다. RV가 perfusate 가득되었는지 확인하고 폐동맥을 cannulate. 그것이 공기 방울을 방지하기 위해 삽입하는 동안 정맥이 완전히 perfusate들로 구성이되어 있는지 확인하십시오. 폐동맥으로 정맥을 봉합해. 4. 신호 수집 : 압력, Monophasic 액션 후보, 그리고 fNADH biventricular cannulation가 완료되면 조심스럽게 대동맥의 정맥을 통해 대동맥으로 압력 변환기의 카테터 (밀라)를 삽입합니다. 부드럽게 대동맥 밸브 과거와 LV로 그것을 이동하십시오. 카테터 선단의 적절한 포지셔닝을 보장하기 LV 압력 신호를 모니터링합니다. LV 압력의 예를 나타납니다그림 1인치 부드럽게 심실 epicardium 대해 monophasic 실천 가능성 전극을 누르십시오. 적절한 조치 잠재력 측정을 달성하기 위해 신호를 모니터링합니다. 신호에 약간의 모션 유물은 정상입니다. 마음을 맞춰 권리 아트리움에서 바이폴라 자극 전극을 삽입합니다. 우리의 프로토콜에서, 마음은 각각 200 400 BPM에 해당하는 300과 150 밀리초 사이의 사이클 길이,에서 진행했다. LV epicardial 표면의 온도를 측정합니다. 연구는 온도가 37로 유지하는 것이 필요한 경우 ° C ~ 후 물을 외피 심장 챔버 또는 잠수함 심장 내내 일정한 온도를 유지하기 위해 예열 superfusate 욕조에서 심장 내부의 마음을 배치. CCD 카메라 (Andor iXon DV860, 128×128 픽셀)에 자리잡고 전망이 해당 필드가 관찰되는 렌즈와 같은 초점을 맞춥니다. 카메라 워크 스테이션에 연결되어 있고 이미지가 Andor SOLIS softwa를 사용하여 두 프레임에 인수된다정말 기쁩니다. 이전 이미징의 시작으로 수은 램프 라이트를 켭니다. 라이트는 심장의 표면을 밝게하기 위해 여기 필터 (350 ± 25 nm의, 채도 기술)를 통해 광섬유 라이트 가이드 (Horiba Jobin Yvon 모델 1950-1M)로 이동합니다. 라이트 가이드를 통해 자외선 광 감쇄는 작아요. 자외선 조명도 LED는 스포트 라이트로 구성된 고전력 LED는 시스템 (Mightex의 PLS-0365-030-S)와 제어 장치 (Mightex SLC-SA04-US)을 사용하여 제공될 수 있습니다. 실내 조명을 끄고 모든 주변 조명을 최소화. 균일한 epicardial 조명을 달성하기 위해 심장에 빛의 가이드 (또는 LED 스포트 라이트)의 ferrules를 목표로합니다. 방출 NADH 형광 (fNADH)는 방출 필터 (460 ± 20 nm의 채도 기술)를 통과하여 CCD 카메라에 의해 몇 군데있다. 이미징 소프트웨어를 사용하여 관심 영역을 선택하여 시간이 지남에 fNADH 변경 사항을 모니터링합니다. 지역 O 내에 평균 픽셀 강도를 모니터링하기 위해 살고 업데이트 모드를 선택하십시오F 관심. 심장은 적절한 압력을 생성하는 biventricular 작업 모드로 작동되어야합니다. fNADH 수준은 적절한 관상 동맥 재관류를 확인 epicardial 표면 위로 낮게하고 안정해야합니다. 연구의이 시점에서 구체적인 실험 프로토콜은 가설을 테스트하기 위해 구현해야합니다. 연구가 완료되면 시스템에서 심장을 제거하고 모든 perfusate 드레인. 물을 정화와 시스템 튜브와 챔버를 씻어. 정기 점검 내용은 시스템이 주기적으로 Mucasol 솔루션이나 필요에 따라 희석 과산화수소 용액과 함께 씻어서해야합니다. 5. fNADH 이미지의 오프라인 처리 NADH 데이터 세트를 비교할 수있는 방법 중 하나 (fNADH (I, J, T)) 실험 사이 참조 이미지를 사용하여 각 형광 이미지를 정상화하는 것입니다 아래의 방정식에 표시된 데이터 세트 9 (fNADH (I, J, T 0)), . NADH 형광을 정상화하는 또 다른 방법은 PL에게ACE 실험 9, 18, ​​19 이전보기의 분야에서 uranyl 유리의 작은 조각. 안정적인 참고 자료로 사용할 수있는 신호를 제공하기 위해 자외선과 조명 – Uranyl 유리 것입니다 형광 (550 nm의 450). 6. 대표 결과 biventricular 작업 토끼 심장 준비 앞부분과 기저 전망은 그림 1에 표시됩니다. 왼쪽 심실 압력이 대동맥 밸브 과거와 좌심실에 압력 변환기의 카테터 (밀라 SPR-407)를 이동하여 측정되었다. 대동맥, 폐동맥, 좌우 심실 압력 (LVP)은 그림 1C에 표시됩니다. Diastolic LVP는 보통 0 사이와 10 mmHg이다. 최소 diastolic 대동맥 압력은 약 60 mmHg이다. 피크 수축기 LVP는 충전 압력 (미리이나 라 압력)와 수축성에 의존적일 수그리고, 최적, 80 및 100 mmHg 사이 여야합니다. 그림 1C와 같이 최대 대동맥 압력과 최대 LVP는 밀접하게 일치해야합니다. 토끼의 마음을위한 전형적인 빠른 탈분극 단계 및 repolarization 단계로 Monophasic 실천 가능성은 (MAPS) 그림 1D 표시됩니다. 그림 1D와 같이지도는, 계약의 마음에서 비교적 쉽게 기록할 수 있지만 일반적으로 심장 확장하는 동안 작은 움직임 유물을해야합니다. 지도 서성 동안 심장 (캡쳐)의 성공적인 진입을 확인하는 데 유용하며 국소 빈혈 또는 다른 급성 perturbations로 인해 로컬 electrophysiological 변화를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. ECG도 따뜻한 superfusate의 목욕탕에서 심장을 잠수함이 잠수과 심장의 왼쪽과 오른쪽 양쪽에있는 목욕탕에 전극을 배치하여 측정 수 있습니다. 셋째 무관심 전극은 어느 거리에 심장에서, 목욕탕에 배치되거나 대동맥에 첨부되어 있습니다.ECG는 전반적인 전기적 기능을 평가 및 국소 빈혈의 존재를 드러내는 데 유용 글로벌 여기와 repolarization 프로세스에 관한 정보를 제공합니다. fNADH 이미징은 허혈성 또는 hypoxic 지역 spatiotemporal 진행을 측정하는 데 사용할 수있는 심장 mitochondrial 산화 환원 상태의 변화를 보여준다. 본 연구의 경우 epicardial fNADH는주기 300 길이 (CLS), 200, 150 밀리초 세 서성 요금 중 산화 환원 상태의 변화를 모니터링하는 측정되었다. 관심 지역 (빨간색 상자, 그림 2)에서 평균 fNADH 값은주기 길이가 단축되면 기준 fNADH 수준이 증가한다는 것을 보여주기. 속도를 서성 때하면 기준 fNADH 수준이 상대적으로 일정 부비동 리듬 (CL = 300 밀리초)에 인접해 있습니다. 사이클의 길이는 짧은 CL (150 밀리초)에서 가장 큰 증가 300 밀리초, 기준 fNADH 수준 증가, 아래 단축되고 있습니다. 전체 앞부분은 표면의 고해상도 이미징 fNADH200 400 BPM은 그림 3에 표시됩니다. 200 BPM에 fNADH 수준은 지속 및 spatially 균질했다. 400 BPM, fNADH 수준 epicardium에 걸쳐 크게 증가했다. 중요한 공간적 이질은 RV와 LV의 septal 지역 내에서 발생하는 최대 규모의 증가와 함께 관찰되었다. fNADH 신호 수축 (모션 유물)로 진동하고 진동의 주파수는 심장 박동 (그림 2)에 해당합니다. biventricular cannulation에서, 마음의 기본은 자궁이 수축하는 동안 스윙에서 심장을 방지하는 데 도움이 네 캐뉼러에 의해 개최됩니다. 따라서 진동 진폭은 더 이상 시간 척도 (5-10 초) 국소 빈혈이나 hypoxia로 인해 발생하는 fNADH의 동향보다 항상 작습니다. 1 그림. 격리된 biventricular의 전형적인 압력과 monophasic 행동 잠재력은 라스 근무bbit 심장. 네 개의 캐뉼러 보여주는 마음의 A. 자연적으로 흐르는 것과, 반사적으로 흐르는보기 :; 2, 폐동맥, 1, 대동맥 오른쪽 심방 및 4 B. 좌심실 (LV)을 보여주는 심장의 앞쪽에 전망과 우심실을, 3, 심방 떠났어. (RV). C. 담당자 압력. 탑 : 왼쪽 심실 압력 (실선)과 대동맥 압력 (점선). 하단 :. 폐동맥 압력 D. 대표 monophasic 액션 잠재력. 신호가 패널 C로 표시된 압력에 부합되는 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오 . 그림 2. 토끼 심장을 작동 격리된 biventricular의 fNADH 이미징. 탑 볼 (왼쪽)과 세 fNADH 영상 분야의 만평이 표시됩니다. 해당 서성주기 길이 (CL)가 각 이미지에 표시됩니다.하단 패널의 fNADH 신호에 대한 관심이 지역은 빨간색 상자로 표시됩니다. monophasic 작업 잠재 전극의 끝부분은 관심 영역의 오른쪽에 보인다. epicardium는 그림 5와 같이, 수은 램프와 라이트 가이드를 사용하여 조명했다. 만이 관심의 영역을 둘러싼 epicardial 표면이 켜지지되었다 회 :. 관심 지역에 관한 fNADH은 상단 패널에 빨간색 상자로 표시. 감소 사이클 길이가 평균 fNADH 증가합니다. 그림 3. 토끼 심장을 작동 격리된 biventricular의 전체 앞부분은 표면의 fNADH 이미지. 마음이 200 BPM 400 BPM에서 RA에서 진행했습니다. 이 고전력 LED는 (Mightex PLS-0365-030-S, 365 nm의 4 %를 사용하여 전체 앞쪽에 epicardium를 조명하면서 fNADH은 (2 FPS, 0.4 mm의 해상도 128×128 픽셀) 몇 군데해서,ntensity, 50 MW 최대).