NADH Fluorescence Imaging of Isolated Biventricular Working Rabbit Hearts

Huda Asfour; Anastasia M. Wengrowski; Rafael Jaimes III; Luther M. Swift; Matthew W. Kay

doi:10.3791/4115

JoVE Journal > Medicine

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Tıp

NADH fluorescentie beeldvorming van geïsoleerde Biventriculaire Werken Rabbit Hearts

Published: July 24, 2012

doi:

10.3791/4115

Huda Asfour¹, Anastasia M. Wengrowski¹, Rafael Jaimes III¹, Luther M. Swift², Matthew W. Kay¹

¹Electrical and Computer Engineering Department,The George Washington University, ²Pharmacology and Physiology Department,The George Washington University

Özet

Het doel is om de mitochondriale redox toestand van geïsoleerde harten te volgen in het kader van fysiologische preload en afterload druk. Een biventriculaire werken konijn hart model wordt gepresenteerd. Hoge resolutie tijdruimtelijke fluorescentie beeldvorming van NADH wordt gebruikt om de mitochondriale redox staat epicardiale weefsel volgen.

Abstract

Sinds de oprichting door Langendorff ^1, de geïsoleerde geperfuseerde hart blijft een prominent instrument voor het bestuderen van cardiale fysiologie ^2. Het is echter niet goed geschikt voor de studie van hart-metabolisme, dat vereist dat het hart het verrichten van werkzaamheden in het kader van fysiologische preload en afterload druk. Neely wijzigingen aangebracht aan de Langendorff techniek passende linker ventrikel (LV) preload en afterload druk ³ vast te stellen. Het model is bekend als het geïsoleerde LV werking hart model is uitgebreid gebruikt voor LV prestaties metabolisme ^4-6 bestuderen. Dit model echter niet een goed geladen rechter ventrikel (RV). Demmy et al.. voor het eerst gemeld een biventriculaire model als een wijziging van de LV werkende hart model ^{7, 8.} Zij vonden dat het slagvolume, cardiac output, en de druk ontwikkeling verbeterd harten omgezet van werken LV modus naar biventriculaire werkmodus ⁸ </sup>. Een goed geladen RV vermindert ook de abnormale druk gradiënten septum om septum functie te verbeteren. Biventriculaire werken harten is aangetoond dat aorta-output, pulmonale flow, betekent aorta druk, hartslag, en myocard ATP op peil te houden voor maximaal 3 uur ^8.

Bij bestudering van de metabole werking van myocard letsel, zoals ischemie, is het vaak nodig om de locatie van het aangetaste weefsel vast. Dit kan door het afbeelden van de fluorescentie van NADH (de gereduceerde vorm van nicotinamide adenine dinucleotide) ^9-11, co-enzym in grote hoeveelheden in de mitochondria. NADH fluorescentie (fNADH) toont een bijna lineaire relatie inverse lokale zuurstofconcentratie ¹² en geeft een maat van mitochondriale redoxtoestand ^13. fNADH beeldvorming in hypoxische en ischemische aandoeningen wordt gebruikt als een kleurstof vrij methode hypoxische gebieden ^{14, 15} vast en de progressie van controlerenhypoxische omstandigheden na verloop van tijd ^10.

Het doel van de methode is om de mitochondriale redox toestand van biventriculaire werken harten te volgen tijdens protocollen die de snelheid van myocyte metabolisme te veranderen of aan te zetten hypoxie of een combinatie van de twee. Hearts uit Nieuw-Zeeland witte konijnen werden aangesloten op een biventriculaire werkende hart-systeem (Hugo Sachs Elektronik) en geperfuseerd met gemodificeerde Krebs-Henseleit oplossing ¹⁶ bij 37 ° C. Aorta, LV, longslagader, en links en rechts atrium druk werden geregistreerd. Elektrische activiteit werd gemeten met behulp van een monofasische actiepotentiaal elektrode. Om beeld fNADH, werd licht van een kwiklamp gefilterd (350 ± 25 nm) en gebruikt om de epicard verlichten. Uitgezonden licht werd gefilterd (460 ± 20 nm) en beeld gebracht met behulp van een CCD-camera. Veranderingen in de epicardiale fNADH van biventriculaire werken harten tijdens verschillende stimulatiefrequenties worden gepresenteerd. De combinatie van het hart model en fNADH imagingbiedt een nieuwe en waardevolle experimentele tool voor het bestuderen acute cardiale pathologie in het kader van realistische fysiologische omstandigheden.

Protocol

1. Instellen voor de Studie Bereid vier liter gemodificeerde Krebs-Henseleit-oplossing 16 (in mM: 118 NaCl, 3,30 KCl, 2,00 CaCl2, 1,20 MgSÛ4 24,0 NaHCÛ3 1,20 KH PO 2 4 10,0 glucose, 2,00 NaPyruvate en 20,0 mg / L albumine ). De oplossing dient zo dicht bij de start van het experiment mogelijk. De pH-waarde dient te worden aangepast tot 7,4 na de steriele filtering (poriegrootte: 22 micrometer, Corning). Oplossing osmolaliteit moet tussen 275 en 295 mOsm / kg. Spoel alle buizen en kamers van het hart te werken met gezuiverd water. De pompen tot al het water verwijderd is van het systeem. Voeg cellulose membraanfilters (poriegrootte: 5 micrometer, Advantec) in overeenstemming met elk van de perfusie pompen (Langendorff perfusie pomp, linker hart perfusie pomp, en rechts het hart perfusie pomp). Voer een tweepuntsijking (0 en 60 mmHg) voor elke druksensor. Zet het water baden. Een verwarmd circulerende waterbad (Cole Palmer) wordt gebruikt om de watermantel buizen en warmtewisselaars te verwarmen. Perfusaat wordt voorverwarmd in een aparte waterbad (Oakton Instruments). Beide baden zijn ingesteld om een oplossing temperatuur van 37 ° C te behouden Zet de pompen naar de perfusievloeistof circuleren in een gesloten lus. Perfusaat passeert microfiber oxygenatoren (hemofilters) vergast met 95% O 2 en 5% CO 2 bij 80 kPa. Geoxygeneerde perfusievloeistof stroomt door warmtewisselaars het op een temperatuur van 37 ° C alvorens het hart canules. 2. Hart Excisie Begin met het instellen van de werkende hart-systeem om te werken in een constante druk Langendorff-modus. Stel de druk van de aorta blok binnen het bereik van 50 tot 60 mmHg. Verdoof de konijn met een intramusculaire injectie van ketamine (44 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg). Nadat het konijn is verdoofd, pentobarbital (50 mg / Kg) en heparine (2000 U) intraveneus ingespoten via de marginale oor ader of de laterale vene aan de binnenzijde van de achterpoot. Als het konijn volledig is niet-ontvankelijk, zoals bepaald door een gebrek aan pijn reflex, de borstholte snel wordt geopend, het hartzakje wordt gesneden, is de aorta geklemd, en het hart en de longen worden weggesneden. Op dit punt van de longen moeten links worden bevestigd aan het hart om te helpen met het isoleren van de longaders. Isoleren en canule de aorta met een diameter van 5 mm canule die is aangesloten op een injectiespuit gevuld met 60 ml perfusievloeistof en 200 eenheden heparine. Zet de aorta naar de canule met size zero zijden hechtdraad en langzaam druk de spuit naar het hart van bloed te spoelen. 3. Biventriculaire Cannulatie Sluit het hart naar de aorta blok van de werkende hart-systeem. Voorkom lucht in de aorta, die coronaire embolie kan veroorzaken. Het beste is om de canule hechten aan de aorta block door zich de aorta connector schuin en waarbij perfusievloeistof voorzichtig uit de connector druppelen in de canule, terwijl het is bevestigd. Terwijl het hart wordt doorbloed in constante druk Langendorff-modus, verwijder het vet en bindweefsel en zoek de volgende schepen: lagere en hogere vena cava, azygos ader, longslagader, longaders. Ligeren van de vena cava superior. Snijd de longslagader net onder waar het takken naar rechts en links longslagaders. Groep alle resterende vaartuigen (de longaders) tussen het hart en de longen en ligeren ze allemaal met behulp van een hechtdraad. Verwijder de longen. Knip een klein gaatje in de hoek van de linker atrium aanhangsel. Zorg ervoor dat de LA is gevuld met perfusaat. Canule de LA, terwijl ervoor te zorgen dat de canule volledig is gevuld met perfusaat terwijl het wordt geplaatst. Hecht de canule aan de LA aanhangsel. Zet de linkerzijde (pomp # 2) flow tverliet hij atrium. Stel voorspanning druk tussen 2 – 6 mmHg en pas ± 2 mm Hg, zoals bepaald door atriale dilatatie. Schakel het hart naar de werkende hart modus door het uitschakelen van de Langendorff pomp (pomp # 1). Momenteel verlagen aortadruk 10 mmHg en langzaam stijgen binnen het bereik van 80 tot 100 mmHg. Hierdoor kan de aortaklep openen en zoals bij het normale fysiologische omstandigheden tijdens functioneren. De laatste afterload druk hangt af van de contractiliteit van de LV. Er dient te worden ingesteld op een waarde die ongeveer 20 mmHg minder dan piek LV druk. LV hartminuutvolume kan worden bepaald door de stroomsnelheid van perfusievloeistof verlaten van de aorta blok (ml / min). Normaal hartminuutvolume tussen 14,77 en 16,43 ml / min per 100 g lichaamsgewicht 17 en gemiddeld 340 ml / min voor 2,2 kg konijn. Aortadruk moet het druksignaal in figuur 1 lijken. Canule de RA door inferior vena cava. Zorg ervoor dat zowel de RA en de canule volledig zijn gevuld met perfusaat en plaats de canule, terwijl het voorkomen van de vorming van luchtbellen. Hechtdraad de canule de ader. Draai aan de rechterkant pomp (pomp # 3) stromen te verlenen aan de rechterboezem. Stel de druk tot ca. 3 mmHg. Zorg ervoor dat de RV is gevuld met perfusaat en canule de longslagader. Controleer de canule geheel gevuld is met perfusievloeistof terwijl het wordt geplaatst om luchtbellen voorkomen. Hecht de canule aan de longslagader. 4. Signal Acquisition: druk, Monofasisch actiepotentialen, en fNADH Zodra biventriculaire cannulatie is voltooid, plaatst voorzichtig de druksensor katheter (Millar) in de aorta via de aorta canule. Voorzichtig varen er voorbij de aortaklep in de LV. Controleer de LV druksignaal een goede positionering van de kathetertip waarborgen. Een voorbeeld van LV druk wordtin figuur 1. Druk de monofasische actiepotentiaal elektrode tegen ventriculaire epicard. Controleer het signaal om passende maatregelen te potentiaal metingen te bereiken. Lichte bewegingsartefacten in het signaal is normaal. Plaats een bipolaire stimulans elektrode op de rechterboezem in het hart tempo. In ons protocol, harten waren tempo op cyclus lengte tussen 300 en 150 msec, wat overeenkomt met 200 en 400 slagen per minuut, respectievelijk. Meet de temperatuur van de LV epicardiale oppervlak. Indien de studie moet de temperatuur gehandhaafd op 37 ° C plaats vervolgens het hart in een watermantel hartkamer of onderdompelen hart in een verwarmde superfusate bad met een constante temperatuur te handhaven tijdens het hart. Plaats de CCD-camera (Andor IXON DV860, 128×128 pixels) en de focus van de lens zodanig dat een passende gezichtsveld wordt waargenomen. De camera is aangesloten op een werkstation en de beelden werden op 2 fps met Andor SOLIS Softwabent. Zet het kwik lamp licht voor de start van de beeldvorming. Licht wordt via een excitatiefilter (350 ± 25 nm, Chroma Technology) en een glasvezel lichtgeleider (Horiba Jobin Yvon model 1950-1M) op het oppervlak van het hart verlichten. De demping van UV-licht door de lichtgeleider is klein. UV-verlichting kan ook worden geleverd met behulp van een high power LED-systeem dat bestaat uit LED-spots (Mightex PLS-0365-030-S) en een controle-eenheid (Mightex SLC-SA04-US). Zet de kamer licht en minimaliseren sfeerverlichting. Richt de adereindhulzen van de lichtgeleider (of LED spots) in het hart om een uniforme epicardiale verlichting te bereiken. Uitgezonden NADH fluorescentie (fNADH) loopt door een emissie-filter (460 ± 20 nm Chroma Technology) en wordt afgebeeld door de CCD-camera. Monitor fNADH veranderingen in de tijd door het selecteren van een regio van belang het gebruik van de imaging software. Selecteer live-update-modus aan de gemiddelde pixel intensiteit van toezicht binnen de regio of belang. Het hart moet functioneren in biventriculaire werkmodus de juiste druk te genereren. fNADH niveaus moeten laag en stabiel te zijn over de epicardiale oppervlak om voldoende coronaire perfusie te bevestigen. Op dit punt in de studie een specifieke experimentele protocol moet worden uitgevoerd om een hypothese te testen. Wanneer het onderzoek is voltooid, verwijdert het hart van het systeem en laat alle perfusaat. Spoel het systeem buizen en kamers met gezuiverd water. Voor onderhoud, moet het systeem gespoeld met periodiek Mucasol oplossing of een verdunde waterstofperoxide nodig. 5. Off-line verwerking van fNADH Images Een manier om NADH datasets vergelijken (fNADH (i, j, t)) tussen experimenten is genormaliseerd elke fluorescentie beeld met een referentiebeeld (fNADH (i, j, t 0)) van de dataset 9 als aangegeven in de onderstaande vergelijking . Een andere manier om NADH fluorescentie normaliseren is het place een stukje uranyl glas in het beeldveld voor het experiment 9, 18, 19. Uranyl glas fluorescentie (450 – 550 nm) bij verlichting met UV licht om een signaal dat kan worden gebruikt als een stabiel verschaffen. 6. Representatieve resultaten Voorste en basale aanzichten van een biventriculaire werkende konijnenhart preparaat in figuur 1. Linker ventrikel druk werd gemeten door het navigeren van een druksensor katheter (Millar SPR-407) voorbij de aortaklep in de linker hartkamer. Aorta, pulmonale en linker ventriculaire druk (LVP) worden getoond in figuur 1C. Diastolische LVP meestal tussen 0 en 10 mmHg. De minimale diastolische aortadruk ongeveer 60 mmHg. Peak systolische LVP is afhankelijk van het vullen van druk (de voorbelasting of de LA druk) en de contractiliteiten optimaal moet tussen 80 en 100 mmHg. De maximale aorta en maximale LVP nauw passende, zoals weergegeven in figuur 1C. Monofasische actiepotentialen (MAP's) met een snelle depolarisatie fase en een repolarisatie fase die typisch zijn voor konijnen harten zijn weergegeven in figuur 1D. Kaarten kunnen relatief eenvoudig worden opgenomen van een aanbestedende hart, maar zal kleine bewegingsartefact hebben meestal tijdens de diastole, zoals weergegeven in figuur 1D. MAP bruikbaar voor de bevestiging succesvolle meesleuren van het hart (capture) tijdens stimulatie en kan ook worden gebruikt voor lokale elektrofysiologische veranderingen door ischemie of andere acute verstoringen meten. Een ECG kan ook worden gemeten door het onderdompelen van het hart in een bad van warm superfusate plaatsen en een elektrode in het bad op de linker en rechter zijden van het hart. Een derde elektrode onverschillig of geplaatst in het bad van het hart of is bevestigd aan de aorta.Een ECG geeft informatie over de wereldwijde opwinding en repolarisatie proces, dat is handig voor evaluatie van de totale elektrische functie en voor het onthullen van de aanwezigheid van ischemie. fNADH beeldvorming toont veranderingen in de mitochondriale redox toestand van het hart, die kan worden gebruikt om de progressie van spatiotemporele ischemie of hypoxie regio's te meten. Voor deze studie werd epicardiale fNADH gemeten om veranderingen in redox toestand te controleren gedurende drie stimulatiefrequenties op Cycle lengtes (CLS) van 300, 200 en 150 msec. Gemiddelde fNADH waarden van een gebied van belang (rode doos, figuur 2) blijkt dat de uitgangssituatie fNADH verhogen als de cycluslengte wordt verkort. Wanneer stimulatiefrequentie ligt dicht bij sinusritme (CL = 300 msec) uitgangswaarde fNADH niveau is relatief constant. Als cycluslengte wordt verkort van minder dan 300 msec, baseline fNADH spiegels toenemen, met de grootste toename in de kortste CL (150 msec). Hoge resolutie fNADH beeldvorming van de volledige voorste oppervlak200 en 400 bpm is in figuur 3. fNADH niveaus op 200 bpm waren constant en ruimtelijk homogeen. Bij 400 bpm, fNADH niveaus aanzienlijk toegenomen in de epicard. Belangrijke ruimtelijke heterogeniteit werd waargenomen met de grootste stijging die zich in de septum regio's van de RV en LV. De fNADH signaal schommelt met contractie (bewegingsartefacten) en de frequentie van de trilling komt overeen met de hartslag (figuur 2). In biventriculaire infusen, de basis van het hart bevestigd met 4 canules, waardoor het hart voorkomen zwaaien tijdens contractie. Daarom trillingsamplitude is altijd minder dan een langere tijdschaal (5-10 sec) trends in fNADH die worden veroorzaakt door ischemie of hypoxie. Figuur 1. Typische druk en monofasische actiepotentialen van een geïsoleerde biventriculaire werken rabbit hart. A. Basale uitzicht op het hart met de vier canules: 1, aorta, 2, pulmonale, 3, linker atrium, en 4, rechts atriale B. Anterior uitzicht op het hart met de linker ventrikel (LV) en de rechter hartkamer. (RV). C. Vertegenwoordiger druk. Top: linker ventrikel druk (vaste lijn) en de aorta druk (stippellijn). Onder:. Pulmonale druk D. vertegenwoordiger monofasische actiepotentialen. Het signaal wordt in lijn met de druk weergegeven in panel C. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken . Figuur 2. fNADH beeldvorming van een geïsoleerde biventriculaire werken konijn hart. Boven: Een cartoon van het gezichtsveld (links) en drie fNADH beelden worden getoond. De bijbehorende pacing cyclus lengte (CL) is aangegeven op elke foto.Het gebied van belang voor de fNADH signaal in de bodem is aangegeven met de rode doos. Het uiteinde van de monofasische actiepotentiaal elektrode gezien naar rechts van het gebied van belang. De epicard werd verlicht met een kwiklamp en lichtgeleider, zoals weergegeven in figuur 5. Alleen de epicardiale oppervlak rond het gebied van belang is verlicht Onder:. Gemiddelde fNADH voor de regio van belang aangegeven door het rode vak in het bovenste paneel. Gemiddelde fNADH toeneemt met verminderde cycluslengte. Figuur 3. fNADH beelden van de volledige voorste oppervlak van een geïsoleerde biventriculaire werken konijn hart. Het hart was tempo van de RA op 200 bpm en 400 bpm. fNADH werd in beeld gebracht (2 fps, 128×128 pixels met een resolutie van 0,4 mm), terwijl de verlichting van het gehele voorste epicard met behulp van twee high power LED's (Mightex PLS-0365-030-S, 365 nm, 4% intensity, 50 mW max).

Discussion

De geïsoleerde Langendorff geperfuseerde hart blijft een prominent instrument voor het bestuderen van cardiale fysiologie ^2. Het is vooral nuttig in studies van hartritmestoornissen, met name degenen die fluorescentie beeldvorming van transmembraan potentiële ²⁰ te gebruiken. Een voordeel is dat de gehele epicardium van de geïsoleerde hart kan ^{21, 22} worden waargenomen. Een ander voordeel is dat, in tegenstelling tot bloed perfusie met een duidelijke kristalloïde bufferoplossing niet hindert fluorescentie signalen. Een beperking is dat de techniek niet Langendorff is zeer geschikt voor de studie van hart-metabolisme, die vaak het hart het verrichten van werkzaamheden in het kader van fysiologische preload en afterload druk.

Om de relevantie van geïsoleerde hart voorbereidingen voor metabole studies, Neely wijzigingen aangebracht aan de Langendorff techniek passende linker ventrikel (LV) preload en afterload druk ³ tot stand te verheffen.Het model is bekend als het geïsoleerde LV werking hart model is uitgebreid gebruikt voor LV prestaties metabolisme ^4-6 bestuderen. De LV werkende hart-model superieur is aan de Langendorff model voor functionele evaluaties, maar het biedt geen goed geladen rechter ventrikel (RV). Demmy et al.. voor het eerst gemeld een biventriculaire model (LV & RV) als een wijziging van de LV werkende hart model ^{7, 8.} Zij vonden dat het slagvolume, cardiac output, en de druk ontwikkeling verbeterd harten omgezet van werken LV modus naar biventriculaire werkmodus ^8. Een goed geladen RV verbetert ook de septum-functie door het verminderen van abnormale druk gradiënten septum. Biventriculaire werken harten is aangetoond dat aorta-output, pulmonale flow, betekent aorta druk, gemiddelde pulmonale druk, hartslag en myocard ATP en creatine fosfaat op peil te houden voor maximaal 3 uur ^8. Biventriculaire werken hart studies doorgaans gebruik harten frOM kleine dieren, zoals ratten en konijnen, omdat het hartminuutvolume en de benodigde hoeveelheid perfusievloeistof veel kleiner dan die van harten van grotere dieren. Echter biventriculaire werken hart studies uitgevoerd met harten van varkens, honden en de mens zelfs ^{23, 24.}

De metabole vraag van geïsoleerde harten in biventriculaire werkende modus is aanzienlijk hoger dan die van Langendorff perfusie. Het is belangrijk dat de perfusievloeistof oplossing genoeg zuurstof en metabolische substraat biventriculaire hartfunctie ondersteunen. Standaard kristalloïde bufferoplossingen, zoals Krebs-Henseleit ^{16, 17, 25} of Tyrodes ^{26, 27} hebben zuurstof oplosbaarheden zo hoog als 5,6 mg / L. Wanneer deze oplossingen worden vergast met carbogen (een gas mengsel van 95% O ₂ en 5% CO ₂₎ en bevat passende metabole substraat (glucose, dextrose, en / of natrium pyruvaat), zijn ze geschikt voor biventriculaire werken harten slaan op normal sinus tarieven (ongeveer 180 bpm voor een konijn).

Metabole stijgingen in de vraag voor een snelle ritmes en de hoeveelheid opgeloste zuurstof in standaard perfusates misschien niet genoeg om volledig te ondersteunen een biventriculaire werkende hart dat krimpt bij hoge tarieven. Crystalloïde bufferoplossingen die erythrocyten of gemengd met bloed werden gebruikt in het werken hart preparaten voldoende zuurstof beschikbaarheid. Eerdere studies hebben aangetoond dat het toevoegen van erytrocyten aan een Krebs-Henseleit-oplossing werkt werking van het hart verbeterd tijdens strenge pacing protocollen en ook de daling van de incidentie van ventriculaire fibrillatie ^16. Een beperking van het gebruik erythrocyten of mengsels van bloed dat hemoglobine interfereert met golflengten die worden gebruikt voor fluorescentie beeldvorming ^13. Andere substraten, zoals albumine, kunnen ook worden toegevoegd aan oplossingen perfusievloeistof naar het hart levensvatbaarheid verlengd en oedeem ²⁸ verminderen.

Tijdens fluorescentie beeldvorming de intensiteit van het excitatie-lampje moet hoog zijn en de lichtverdeling moeten uniform zijn. Tot uniforme belichting is niet altijd gemakkelijk door de kromming van het oppervlak epicardiale. In onze studies hebben we beeld fNADH door het filteren van het licht (350 ± 25 nm) van een kwiklamp. Een vorkvormig glasvezel lichtgeleider wordt gebruikt om de UV-licht op het oppervlak epicardiale leiden. Gelijkmatig licht kan worden bereikt door geschikte plaatsing van de twee uitgangspoorten ferrules. UV LED lichtbronnen kunnen ook worden gebruikt, We hebben aangetoond in figuur 3. LED-bronnen zijn relatief goedkoop, zodat meerdere bronnen kunnen worden opgenomen in een imaging systeem. LED's kunnen ook worden gefietst aan en uit bij hoge tarieven naar excitatielicht synchroniseren met beeld acquisitie.

Fotobleken van NADH worden geminimaliseerd ²⁹ door de tijd van weefsel verlichting. Dit kan door de verlichting fietsen en uitschakelen met een elektronic sluiter en een lamp of met een LED-verlichting en een controller. Als de verlichting wordt gesynchroniseerd met de hartcyclus, dan fNADH beeldopname kan worden beperkt tot diastole, die bewegingsartefacten verminderen de fluorescentie signalen. Trigging verlichting en beeldacquisitie met behulp van een druk-signaal, zoals de LV druk, zou een manier zijn om dit te doen zijn.

In onze studies hebben we geconstateerd dat de veranderingen in fNADH per tijdseenheid kan meer dan 5x hoger op 400 bpm dan op 200 bpm. Dit geeft aan dat snelle ritmes verheffen de redox toestand van het hart. Of dit wordt veroorzaakt door hypoxie of het onvermogen van myocyten om NADH te oxideren tot NAD + snel genoeg om de accumulatie van NADH te vermijden is nog steeds een onbeantwoorde vraag.

De prestaties van een biventriculaire werkende hart voorbereiding is afhankelijk van meerdere factoren. Een van de belangrijkste is de juiste voorspanning en afterload druk op de fysiologische na te bootsenvoorwaarden die in onderzoek zijn. In het bijzonder moet de LV afterload (aorta druk) worden aangepast aan de druk van te vertegenwoordigen. Als het te hoog is, zal de LV niet kunnen de druk te overwinnen, waardoor lekkage. Druk die te laag is zal negatieve invloed hebben op coronaire perfusie. De LV preload druk (linker atrium druk) moeten ook worden aangepast om een einde te diastolische volume dat geschikt is voor de experimentele protocol te bieden.

fNADH beeldvorming van levend weefsel is een gevestigde vorm van fluorescentie beeldvorming ^13. De toepassing op hartweefsel werd geïllustreerd door Barlow en Chance als ze gemeld opvallende verhogingen van fNADH in regionaal ischemisch weefsel na ligatie van een coronaire vat ^14. Hun fNADH beelden werden vastgelegd op film met een Fairchild oscilloscoop camera en UV-flitsfotografie. Coremans et al.. uitgebreid op dit concept met behulp van de NADH fluorescentie / UV-reflectie verhouding tot meetbaree de metabole toestand van het epicard van Langendorff bloed-geperfuseerde rattenharten ^30. Een videofluorimeter werd gebruikt voor beeldvorming en gegevens werden opgenomen met een videorecorder. Later, Scholz et al.. gebruik gemaakt van een spectrograaf en fotodiode array om de gemiddelde fNADH te meten uit een groot gebied van de LV. Deze benadering beperkt de effecten van epicardiale fluorescentie heterogeniteiten en lokale variaties in omloop met het tonen van macroscopische werk-gerelateerde variaties van fNADH ^31. Deze benadering is vergelijkbaar met computer gemiddelde fNADH niveaus een gebied van belang in alle frames van een fNADH imaging dataset, zoals geïllustreerd in figuur 2. Zoals we in dit artikel, de technologie van vandaag zorgt voor een hoge snelheid CCD-camera's en digitaal gestuurde high-power UV-spots. Deze technologieën maken de spatiotemporele dynamiek van fNADH en cardiale metabolisme te bestuderen van de vele nieuwe perspectieven. De relatief lage kosten van de optica en lichtbron maakt fNADH imaging nuttig accessoire voor conventionele cardiale optische karteringssystemen. ^{9, 32}

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de NIH (R01-HL095828 op MW Kay).

Materials

Chemical	Company	Catalogue Number
NaCl	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	S-3014
KCl	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	P3911-500G
CaCl₂	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ	C77-500
MgSO₄	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	M-7506
NaHCO₃	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ	S-233
KH₂PO₄	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ	423-316
Glucose	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	158968-500G
NaPyruvate	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	P2256-25G
Albumin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A9418-100G

Referanslar

Langendorff, O. Untersuchungen am uberlebenden saugethierherzen [investigations on the surviving mammalian heart]. Arch. Gesante Physiol. 61, 291-332 .
Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to langendorff—still viable in the new millennium. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 55, 113-126 (2007).
Neely, J. R., Liebermeister, H., Battersby, E. J., Morgan, H. E. Effect of pressure development on oxygen consumption by isolated rat heart. Am. J. Physiol. 212, 804-814 (1967).
Feng, H. Z., Jin, J. P. Coexistence of cardiac troponin T variants reduces heart efficiency. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299, H97-H105 (2010).
Clemens, M. G., Forrester, T. Appearance of adenosine triphosphate in the coronary sinus effluent from isolated working rat heart in response to hypoxia. J. Physiol. 312, 143-158 (1981).
Cole, M. A., Murray, A. J., Cochlin, L. E., Heather, L. C., McAleese, S., Knight, N. S., Sutton, E., Jamil, A. A., Parassol, N., Clarke, K. A high fat diet increases mitochondrial fatty acid oxidation and uncoupling to decrease efficiency in rat heart. Basic Res. Basic Res. Cardiol. 106, 447-457 (2011).
Demmy, T. L., Curtis, J. J., Kao, R., Schmaltz, R. A., Walls, J. T. Load-insensitive measurements from an isolated perfused biventricular working rat heart. J. Biomed. Sci. 4, 111-119 (1997).
Demmy, T. L., Magovern, G. J., Kao, R. L. Isolated biventricular working rat heart preparation. Ann. Thorac. Surg. 54, 915-920 (1992).
Kay, M., Swift, L., Martell, B., Arutunyan, A., Sarvazyan, N. Locations of ectopic beats coincide with spatial gradients of NADH in a regional model of low-flow reperfusion. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 2400-2405 (2008).
Swift, L., Martell, B., Khatri, V., Arutunyan, A., Sarvazyan, N., Kay, M. Controlled regional hypoperfusion in langendorff heart preparations. Physiol. Meas. 29, 269-279 (2008).
Kay, M. W., Swift, L. M., Sangave, A., Zderic, V. High resolution contrast ultrasound and NADH fluorescence imaging of myocardial perfusion in excised rat hearts. , 1-4 (2008).
Chance, B. Pyridine nucleotide as an indicator of the oxygen requirements for energy-linked functions of mitochondria. Circ. Res. 38, I31-I38 (1976).
Mayevsky, A., Rogatsky, G. G. Mitochondrial function in vivo evaluated by NADH fluorescence: From animal models to human studies. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 292, C615-C640 (2007).
Barlow, C. H., Chance, B. Ischemic areas in perfused rat hearts: Measurement by NADH fluorescence photography. Science. 193, 909-910 (1976).
Mayevsky, A., Chance, B. Oxidation-reduction states of NADH in vivo: From animals to clinical use. Mitochondrion. 7, 330-339 (2007).
Gillis, A. M., Kulisz, E., Mathison, H. J. Cardiac electrophysiological variables in blood-perfused and buffer-perfused, isolated, working rabbit heart. Am. J. Physiol. 271, H784-H789 (1996).
Ôta, K., Peaker, M. Lactation in the rabbit: Mammary blood flow and cardiac output. Experimental Physiology. 64, 225-238 (1979).
Ashruf, J. F., Ince, C., Bruining, H. A. Regional ischemia in hypertrophic langendorff-perfused rat hearts. Am. J. Physiol. 277, H1532-H1539 (1999).
Ashruf, J. F., Coremans, J. M., Bruining, H. A., Ince, C. Increase of cardiac work is associated with decrease of mitochondrial NADH. Am. J. Physiol. 269, 856-862 (1995).
Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ. Res. 95, 21-33 (2004).
Rogers, J. M., Walcott, G. P., Gladden, J. D., Melnick, S. B., Kay, M. W. Panoramic optical mapping reveals continuous epicardial reentry during ventricular fibrillation in the isolated swine heart. Biophys. J. 92, 1090-1095 (2007).
Qu, F., Ripplinger, C. M., Nikolski, V. P., Grimm, C., Efimov, I. R. Three-dimensional panoramic imaging of cardiac arrhythmias in rabbit heart. J. Biomed. Opt. 12, 044019 (2007).
Chinchoy, E., Soule, C. L., Houlton, A. J., Gallagher, W. J., Hjelle, M. A., Laske, T. G., Morissette, J., Iaizzo, P. A. Isolated four-chamber working swine heart model. Ann. Thorac. Surg. 70, 1607-1614 (2000).
Hill, A. J., Laske, T. G., Coles, J. A., Sigg, D. C., Skadsberg, N. D., Vincent, S. A., Soule, C. L., Gallagher, W. J., Iaizzo, P. A. In vitro studies of human hearts. Ann. Thorac. Surg. 79, 168-177 (2005).
Schenkman, K. A. Cardiac performance as a function of intracellular oxygen tension in buffer-perfused hearts. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 281, H2463-H2472 (2001).
Pijl, A. J., Pfaffendorf, M., Mathy, M., Van Zwieten, P. A. Cardioprotection by nifedipine in isolated working hearts: A comparative study on three different types of experimental ischemia. J. Cardiovasc. Pharmacol. 21, 70-76 (1993).
Khatib, S. Y., Boyett, M. R. Effects of glyburide (glibenclamide) on myocardial function in langendorff perfused rabbit heart and on myocardial contractility and slow calcium current in guinea-pig single myocytes. Mol. Cell Biochem. 242, 81-87 (2003).
Kates, R. E., Yee, Y. G., Hill, I. Effect of albumin on the electrophysiologic stability of isolated perfused rabbit hearts. J. Cardiovasc. Pharmacol. 13, 168-172 (1989).
Combs, C. A., Balaban, R. S. Direct imaging of dehydrogenase activity within living cells using enzyme-dependent fluorescence recovery after photobleaching (ED-FRAP). Biophys. J. 80, 2018-2028 (2001).
Coremans, J. M., Ince, C., Bruining, H. A., Puppels, G. J. (Semi-)quantitative analysis of reduced nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence images of blood-perfused rat heart. Biophys J. 72, 1849-1860 (1997).
Scholz, T. D., Laughlin, M. R., Balaban, R. S., Kupriyanov, V. V., Heineman, F. W. Effect of substrate on mitochondrial NADH, cytosolic redox state, and phosphorylated compounds in isolated hearts. Am. J. Physiol. 268, 82-91 (1995).
Holcomb, M. R., Woods, M. C., Uzelac, I., Wikswo, J. P., Gilligan, J. M., Sidorov, V. Y. The potential of dual camera systems for multimodal imaging of cardiac electrophysiology and metabolism. Exp. Biol. Med. (Maywood). 234, 1355-1373 (2009).

Etiketler

NADH Fluorescence Imaging Isolated Perfused Heart Langendorff Technique Cardiac Physiology Cardiac Metabolism LV Working Heart Model Biventricular Model Stroke Volume Cardiac Output Pressure Development Myocardial Injury Ischemia NADH Fluorescence

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Bu Makaleden Alıntı Yapın

Asfour, H., Wengrowski, A. M., Jaimes III, R., Swift, L. M., Kay, M. W. NADH Fluorescence Imaging of Isolated Biventricular Working Rabbit Hearts. J. Vis. Exp. (65), e4115, doi:10.3791/4115 (2012).