NADH的荧光成像隔离双心室工作离体兔心

1。设立研究准备四个改性克雷布斯Henseleit溶液16升（MM： 氯化钙 ，1.20，2.00，3.30氯化钾118氯化钠，24.0 硫酸镁 1.20碳酸氢钠3，KH 2 PO 4计 ，10.0葡萄糖，2.00 NaPyruvate，和20.0毫克/ L，白蛋白）。应准备开始实验尽可能接近的解决方案。 （孔径：22微米，康宁）无菌过滤后，pH值应调整至7.4。溶液渗透压，应该是275和295 mOsm /公斤之间。 用纯化水冲洗管和商会的工作心脏系统。从系统中删除，直到所有的水已经运行泵。 添加纤维素膜过滤器（孔径5微米，Advantec）在用灌注泵（Langendorff灌流泵，左心灌注泵，右心灌注泵）。 执行每个压力传感器的两点校准（0和60毫米汞柱）。 打开水洗澡。一个加热循环水浴（科尔帕尔默）用于地暖的水套式管和热交换器。灌流预温在一个单独的水浴（Oakton仪器）。这两个浴场保持溶液温度37℃ 打开泵在一个闭环循环灌流。灌流通过毒气95％O 2和5％的CO 2在80千帕的超细纤维氧合（hemofilters）的传递。含氧灌流然后流入维持在温度为37°C，进入心脏插管前，通过热交换器。 2。心脏切除首先，设置工作心脏系统的工作在恒压的Langendorff模式。将主动脉块范围内的50至60毫米汞柱的压力。 麻醉兔子肌肉注射氯胺酮（44毫克/公斤）和甲苯噻嗪（10毫克/千克）。后兔是镇静剂，巴比妥（50毫克/ K的g）和静脉注射肝素（2000美）通过耳缘静脉或后肢内侧的横向的大隐静脉。 当兔子是完全不响应，缺乏对疼痛反射确定，胸腔被迅速拉开，心包切片，被夹住主动脉，心脏和肺被切除。肺部此时应留在心脏，以帮助隔离肺静脉。 隔离和cannulate主动脉直径5毫米的套管附加到洋溢着60毫升灌流和200单位肝素注射器。确保主动脉零号丝线缝合的套管，慢慢压下注射器冲洗心脏的血液。 3。双心室插管连接心脏的工作心脏系统的主动脉块。防止空气进入主动脉，可引起冠状动脉栓塞。这是最好的导管主动脉BL玉珠由接近在斜角主动脉的连接和允许灌流轻轻滴入套管连接器，而它是连接。 虽然心灌注在恒压的Langendorff模式，去除脂肪和结缔组织，并找到以下的船只：劣质和上腔静脉，奇静脉，肺动脉，肺静脉。 结扎，上腔静脉。肺动脉略低于削减地方分支机构的左，右肺动脉。 集团余下的所有船只之间的心脏和肺部，并使用1缝合结扎他们（肺静脉）。取出的肺部。 切左心耳在角落的小孔。确保洛杉矶灌流充满。同时确保完全充满灌流套管，当它被插入Cannulate洛杉矶。缝合左心耳插管。 打开泵（泵＃2）左侧提供流动到T他左心房。设置2 – 6毫米汞柱，并调整±2毫米汞柱，确定心房扩张之​​间的预压力。 关闭的Langendorff泵（泵＃1）心脏的工作模式切换心。 一度减少到10毫米汞柱的主动脉压力，然后慢慢增加80至100毫米汞柱的范围内。这将允许打开和运作，因为它会在正常生理条件下的主动脉瓣。最终的负荷压力将取决于的LV收缩。它应设置一个值，比高峰期左室压力减少了约20毫米汞柱。 测定左室心输出量可以通过测量流量的灌流，退出的主动脉块（毫升/分钟）。正常心输出量是14.77和16.43毫升/每分钟100体重17克和平均340毫升/分钟为2.2公斤的兔子。主动脉压力应类似于图1所示的压力信号。 通过I Cannulate的RAnferior腔静脉。确保RA和套管完全充满灌流，并插入导管，同时防止形成气泡。缝合静脉插管。 打开右侧泵（泵＃3）提供流至右心房。设置约3毫米汞柱的压力。 确保房车充满灌流，并cannulate肺动脉。确保套管完全充满灌流，同时它插入，以防止气泡。缝合肺动脉插管。 4。信号采集：压力，单相动作电位，fNADH 双心室插管完成后，小心地插入主动脉的主动脉插管通过压力传感器导管（米勒）。轻轻地浏览过去的主动脉瓣和进LV。监察LV压力信号，以确保导管尖端的正确定位。例如LV的压力在图1。 轻轻按压对心室外膜单相动作电位电极。监测的信号，以实现相应的动作电位测量。在信号轻微的运动伪影是正常的。 一个双极刺激电极放在右心房步伐心。在我们的协议，心中节奏的周期长度在300和150毫秒之间，相应的，分别以200和400 BPM。 测量左室心外膜表面的温度。如果研究的需要，温度保持在37°C，然后放置心内的水套的心腔或淹没在加热灌流浴心保持一个恒定的温度，整个心。 定位的CCD相机（安道尔IXON DV860 128×128像素）和聚焦镜头等观察认为适当的领域。将相机连接到工作站和图像以2 fps收购使用安道尔SOLIS softwa重。 打开汞灯灯前开始的成像。通过激发滤光片（350±25纳米，色度技术）和光纤光导（HORIBA Jobin Yvon的模型1950-1M）的光被照亮的心脏表面。紫外线光通过光导衰减小。紫外线照射也可提供高功率LED LED射灯组成的系统（Mightex PLS-0365-030-S的）和一个控制单元（SLC-SA04美Mightex）。 关闭室内灯光，并尽量减少任何环境照明。着眼于心脏的光导（或LED射灯）套圈，以实现统一的外膜照明。发出的NADH的荧光（fNADH）通过排放过滤器（460±20 nm的色度技术），是由CCD相机的成像。 监测使用的成像软件的兴趣选择一个地区一段时间fNADH改变。选择生活的更新模式，以监测区域内的直径平均像素强度f利益。 心应在双心室工作模式运作，以产生适当的压力。 fNADH水平应该是在外膜表面低而稳定，以确认足够的冠状动脉灌注。在这点在研究一个具体的实验协议应实施测试假说。 当研究完成后，从系统中删除的心脏，并排出所有的灌流。纯净水冲洗系统管和商会。对于日常​​维护，系统应定期清洗Mucasol解决方案或稀释的双氧水，需要。 5。脱机处理fNADH图片一种方式比较NADH的数据集（fNADH（I，J，T））之间的实验是每个荧光图像，参考图像（正常化fNADH（I，J，T 0））从9数据集，如以下公式所示。 NADH的荧光正常化的另一种方法是对PL王牌小块的铀玻璃在实验前9，18，19场的观点。铀玻璃将荧光紫外灯提供一个可以用来作为一个稳定的参考信号亮起时（450 – 550纳米）。 6。代表结果 如图1所示的双心室兔心脏的准备前，基底意见。左心室压力测量航行过去的主动脉瓣进入左心室压力传感器导管（米勒SPR-407）。主动脉，肺动脉，左心室压力压（LVP）在图1C所示。通常是介于0和10毫米汞柱，舒张压LVP的。最低的舒张主动脉压力是约60毫米汞柱。收缩期峰值LVP是依赖于充盈压（预置或洛杉矶压力）和收缩，优化，应该是80和100毫米汞柱之间。最大的主动脉压力和LVP的最大应密切配合，如在图1C所示。 单相动作电位快速去极化相和复极阶段，是典型的离体兔心（图） 如图1D所示。地图可以相对容易地记录从承包的心，但通常会在舒张小运动伪影， 如图1D所示。地图是用于心脏起搏时（捕获）确认成功夹带，也可以用来衡量当地因缺血或其他急性扰动的电生理改变。心电图也可以测量淹没在浴温暖灌流心脏和电极放置在心脏的左，右两侧的浴。第三无动于衷电极被放置在洗澡，远离心脏，或连接到主动脉。心电图将提供全球激励和复极过程，这是评估整体的电气功能和揭示存在缺血的有用信息。 fNADH成像揭示了心脏的线粒体氧化还原状态的变化，它可以用来测量缺血或缺氧地区的时空进展。在这项研究中，心外膜fNADH测量监控的氧化还原状态的变化，在三个周期长度（CLS），300，200，150毫秒的起搏率。平均fNADH值从感兴趣的区域（红色框， 图2）显示，基线fNADH水平提高，为缩短周期长。当起搏率接近窦性心律（CL = 300毫秒）基线fNADH水平相对恒定。随着周期长度缩短低于300毫秒，“基线fNADH水平的提高，在最短的CL（150毫秒）的增幅最大。高的决议fNADH成像充分的前表面在200和400 BPM是如图3所示。 200 BPM fNADH水平不变和空间均匀。 BPM在400，fNADH水平大幅增加，整个心外膜。显着的空间异质性，观察RV和LV隔地区内发生的最大升幅。 收缩（运动伪影）fNADH信号振荡，振荡频率对应的心跳率（ 图2）。在双心室插管，心脏的基地举行4套管，这有助于防止心脏收缩时的摆动。因此，振荡幅度总是比任何更长的时间尺度（5-10秒）在fNADH的趋势，缺血或缺氧引起的。 图1。典型的压力，从一个孤立的双心室单相动作电位工作RABBIT心脏。显示四个套管心脏基底观点：2，肺动脉，主动脉，左心房，右心房B.前视图显示心脏的左心室（LV）和右心室。 （右）。C.代表的压力。热门：左心室压力（实线）和主动脉压力（虚线）。底部：D.肺动脉高压的代表单相动作电位。在面板C. 点击这里查看大图所示的压力信号对齐。 图2。离体兔心脏双心室fNADH成像。顶部：一个视图（左）和三个fNADH图像领域的卡通显示。每个图像上相应的起搏周期长度（CL）表示。红色框表示地区的利益为底部面板fNADH的信号。单相动作电位电极的尖端被看作是在该地区的利益的权利。心外膜汞灯和光导照明使用， 如图5所示。只底：心外膜表面被照亮了周围地区的利益。平均fNADH由该地区的利益，在顶部面板中的红色框表示。缩短生产周期长的的平均fNADH增加。 图3。完整的离体兔心脏双心室前壁表面fNADH图像。心脏是从RA在200 bpm和400 BPM的节奏。 fNADH被拍摄（2 fps的128×128像素分辨率0.4毫米），同时使用两个高功率LED（Mightex PLS-0365-030-S 365纳米，4％，照亮了整个前外膜我ntensity，最大50毫瓦）。