NADH Fluorescence Imaging of Isolated Biventricular Working Rabbit Hearts

Huda Asfour; Anastasia M. Wengrowski; Rafael Jaimes III; Luther M. Swift; Matthew W. Kay

doi:10.3791/4115

JoVE Journal > Medicine

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Tıp

NADH الإسفار التصوير من البطينين متفرقة العامل قلوب الأرنب

Published: July 24, 2012

doi:

10.3791/4115

Huda Asfour¹, Anastasia M. Wengrowski¹, Rafael Jaimes III¹, Luther M. Swift², Matthew W. Kay¹

¹Electrical and Computer Engineering Department,The George Washington University, ²Pharmacology and Physiology Department,The George Washington University

Özet

والهدف من ذلك هو رصد حالة الميتوكوندريا الأكسدة من قلوب معزولة في سياق التحميل المسبق الفسيولوجية والضغوط حمولة تلوية. ويرد البطينين قلب أرنب عمل نموذج. ويستخدم ارتفاع القرار المكانية التصوير مضان من NADH لرصد حالة الأكسدة الميتوكوندريا من أنسجة epicardial.

Abstract

منذ تأسيسها من قبل Langendorff ^1، وقلب معزولة perfused يظل أداة بارزة لدراسة علم وظائف الأعضاء في القلب ^2. ومع ذلك، فإنه لا مناسبة تماما لدراسات التمثيل الغذائي في القلب، والتي تتطلب القلب على أداء العمل في سياق التحميل المسبق الفسيولوجية والضغوط حمولة تلوية. أدخلت تعديلات على نيلي تقنية Langendorff لإقامة مناسبة البطين الأيسر (LV) التحميل المسبق والضغوط حمولة تلوية ^3. ويعرف هذا النموذج بوصفه النموذج LV معزولة قلب العمل، واستخدمت على نطاق واسع لدراسة الوقف الأداء والتمثيل الغذائي ^{و 4-6.} هذا النموذج، ومع ذلك، لا يوفر البطين تحميلها بشكل صحيح حق (RV). Demmy وآخرون. وذكرت لأول مرة نموذج البطينين كما تعديلا للقلب LV نموذج للعمل ^{7 و 8.} ووجد الباحثون ان تنمية حجم السكتة الدماغية، خرج القلب، وضغط تحسن في قلوب تحويلها من وضع LV العمل على وضع البطينين تعمل ⁸ </sup>. وRV تحميلها بشكل صحيح يقلل أيضا التدرجات ضغط غير طبيعي عبر الحاجز لتحسين وظيفة الحاجز. وقد ثبت البطينين قلوب العمل للحفاظ على الانتاج الأبهر، وتدفق الرئوي، يعني الضغط الأبهري، معدل ضربات القلب، ومستويات عضلة القلب للاعبي التنس المحترفين لمدة تصل إلى 3 ساعات ^8.

عند دراسة تأثيرات أيضية من اصابة في عضلة القلب، مثل نقص التروية، غالبا ما يكون من الضروري تحديد مكان وجود الأنسجة المتضررة. ويمكن القيام بذلك عن طريق التصوير ومضان من NADH (على شكل انخفاض ثنائي النوكليوتيد الأدينين نيكوتيناميد) ^9-11، وهو أنزيم وجدت بكميات كبيرة في الميتوكوندريا. NADH مضان (fNADH) يعرض وجود علاقة عكسية قرب خطيا مع الأكسجين المحلية ¹² تركيز ويوفر قدرا من الدولة الأكسدة الميتوكوندريا ^13. وقد استخدمت fNADH التصوير في ظروف نقص الأوكسجين ونقص تروية كوسيلة من وسائل صبغة خالية من تحديد مناطق ميتة ^{14 و 15،} ورصد التقدم مننقص الأوكسجين الظروف مع مرور الوقت ^10.

والهدف من هذا الأسلوب هو لرصد حالة الميتوكوندريا الأكسدة من البطينين قلوب العمل خلال البروتوكولات التي تغير من معدل التمثيل الغذائي للخلية عضلية أو حث نقص الأكسجة أو خلق مزيج من الاثنين. تم ربط قلوب من الأرانب البيضاء في نيوزيلندا إلى نظام البطينين قلب العمل (هوغو ساكس الكترونيك) وperfused مع حل كريبس، هنسلايت المعدلة ¹⁶ في 37 درجة مئوية. وسجلت الأبهر، والوقف، الشريان الرئوي، والضغوط الأذيني اليسار واليمين. وقد تم قياس النشاط الكهربائي باستخدام إمكانات العمل حيد الطور الكهربائي. إلى صورة fNADH، تم تصفيتها من ضوء مصباح الزئبق (350 ± 25 نانومتر) وتستخدم لتسليط الضوء على النخاب. تم ترشيح الضوء المنبعث (460 ± 20 نانومتر)، والتقط باستخدام كاميرا CCD. وترد التغييرات في fNADH epicardial من البطينين قلوب العاملين أثناء معدلات سرعة مختلفة. مزيج من نموذج القلب والتصوير fNADHيوفر أداة جديدة وقيمة تجريبية لدراسة الأمراض القلبية الحادة في سياق الظروف الفسيولوجية واقعية.

Protocol

1. إنشاء لدراسة إعداد أربعة لترات من محلول كريبس، هنسلايت المعدلة 16 (في مم: 118 كلوريد الصوديوم، بوكل 3.30، 2.00 CaCl 2، 1.20 MgSO 4، 24.0 NaHCO 3، 1،20 KH 2 PO 4، 10.0 الجلوكوز، NaPyruvate 2.00، و 20.0 ملغم / لتر الزلال ). وينبغي أن يعد الحل أقرب إلى بداية التجربة ممكن. ينبغي تعديل درجة الحموضة إلى 7.4 بعد تصفية العقيمة (حجم المسام: 22 ميكرون، كورنينج). وينبغي أن يكون الحل الأسمولية بين 275 و 295 mOsm / كجم. شطف جميع أنابيب وغرف لأمراض القلب بالتعاون مع الماء النقى. تشغيل المضخات حتى تمت إزالة جميع المياه من النظام. إضافة المرشحات الغشائية السليلوز (حجم المسام: 5 ميكرون، أدفانتيك) تمشيا مع كل من مضخات نضح (Langendorff مضخة نضح، اليسار مضخة نضح القلب، والحق مضخة نضح القلب). إجراء معايرة نقطتين (0 مم زئبق و60) لكل جهاز استشعار الضغط. بدوره على حمامات المياه. ويتم استخدام المياه الساخنة حمام المتداولة (كول بالمر) لتسخين أنابيب المياه تغلف والمبادلات الحرارية. وسائل الإرواء مسبقا تحسنت في حمام ماء منفصلة (أوكتون الآلات). يتم تعيين كل من الحمامات للحفاظ على درجة حرارة المحلول من 37 درجة مئوية. تشغيل مضخات تعميم سائل الإرواء في حلقة مغلقة. سائل الإرواء يمر من خلال اسطوانات الأوكسيجين ستوكات (hemofilters) بالغاز مع 95٪ O 2 و 5٪ CO 2 في 80 كيلو باسكال. سائل الإرواء الاوكسيجين ثم يتدفق من خلال المبادلات الحرارية والحفاظ عليه في درجة حرارة 37 درجة مئوية قبل دخول حقنة عادية في القلب. 2. قلب الختان تبدأ من خلال وضع نظام قلب العمل عملها في وضع ثابت الضغط Langendorff. تعيين الضغط من كتلة الأبهر في نطاق بين 50 و 60 مم زئبق. تخدير الأرنب مع الحقن العضلي من الكيتامين (44 ملغ / كلغ)، وزيلازين (10 ملغ / كلغ). بعد الأرنب هو مخدرا، بنتوباربيتال (50 ملغ / Kز) ويتم حقنه عن طريق الوريد الهيبارين (2000 U) عن طريق الوريد الأذن هامشية أو في الوريد الصافن الوحشي في الداخل من طرف هند. عندما الأرنب هو تماما عدم الاستجابة، وعلى النحو الذي يحدده عدم وجود رد الفعل الألم، وسرعان ما يتم فتح التجويف الصدري، وشرائح بيريكارديوم، وفرضت الشريان الأورطي، ويتم استئصال القلب والرئتين. وينبغي في هذه المرحلة أن تترك الرئتين تعلق على قلب للمساعدة في عزل الأوردة الرئوية. عزل ويقني؛ يدخل القنية الشريان الأورطي مع قنية قطرها 5 ملم التي يتم تركيبها على محقنة مليئة سائل الإرواء مل 60 و 200 وحدة من الهيبارين. تأمين الشريان الأورطي إلى قنية مع حجم صفر خياطة الحرير وخفض ببطء الحقنة لطرد القلب من الدم. 3. البطينين كيفية تركيب الكانيولا ربط القلب إلى الشريان الأبهر من كتلة قلب نظام العمل. منع الهواء من الدخول إلى الشريان الأبهر، الذي يمكن أن يسبب الصمات التاجية. فمن الأفضل أن نعلق قنية إلى BL الأبهراوك من الاقتراب من الموصل الأبهر بزاوية مائلة، والسماح سائل الإرواء إلى بالتنقيط بلطف من الموصل في قنية في حين تتمسك بها. في حين أن perfused القلب في وضع ثابت الضغط Langendorff، وإزالة الأنسجة الدهنية والضامة وتحديد موقع السفن التالية: أقل شأنا والوريد الأجوف العلوي، الوريد الفرد، الشريان الرئوي، الأوردة الرئوية. Ligate في الوريد الأجوف العلوي. قطع الشريان الرئوي أدناه فقط حيث لها فروع في شرايين الرئة اليمنى واليسرى. مجموعة جميع السفن المتبقية (الأوردة الرئوية) بين القلب والرئتين وligate كل منهم باستخدام واحدة خياطة. إزالة الرئتين. قطع ثقب صغير في زاوية لاحقة في الأذين الأيسر. ضمان أن يتم تعبئة مع لوس انجليس لسائل الإرواء. يقني؛ يدخل القنية في لوس انجليس، مع ضمان أن يتم تعبئة تماما مع قنية سائل الإرواء في حين يتم إدراجها. خياطة للقنية إلى ملحق لوس انجليس. بدوره على مضخة الجانب الأيسر (مضخة رقم 2) لتوفير تدفق إلى رغادر الأذين. ضبط ضغط التحميل المسبق بين 2 – 6 ملم زئبقي وضبط ± 2 مم زئبق، على النحو الذي يحدده تمدد الأذيني. تبديل القلب إلى القلب طريقة العمل عن طريق إيقاف المضخة Langendorff (مضخة رقم 1). تخفيض لحظات الضغط إلى 10 مم زئبق الأبهر ثم زيادة ببطء إلى داخل نطاق بين 80 و 100 ملم زئبقي. وهذا سيسمح للصمام الأبهري لفتح وتعمل كما أنه سيكون خلال الظروف الفسيولوجية طبيعية. وضغط حمولة تلوية النهائي يتوقف على انقباض من LV. يجب تعيين إلى قيمة هذا هو ما يقرب من 20 مم زئبق أقل من الضغط المنخفض الذروة. ويمكن تحديد LV القلب الناتج عن طريق قياس معدل تدفق سائل الإرواء الخروج من كتلة الأبهر (مل / دقيقة). القلب الناتج الطبيعي هو بين 14.77 و 16.43 مل / دقيقة لكل 100 غرام من وزن الجسم 17 و المتوسطات 340 مل / دقيقة لأرنب كجم 2.2. ينبغي الضغط الأبهري يشابه إشارة الضغط هو مبين في الشكل رقم 1. يقني؛ يدخل القنية والتهاب المفاصل الروماتويدي خلال طnferior الوريد الأجوف. تأكد من أن تمتلئ تماما كل من التهاب المفاصل الروماتويدي وقنية وسائل الإرواء مع وإدراج قنية في حين منع تشكيل فقاعات الهواء. خياطة للقنية إلى الوريد. بدوره على مضخة الجانب الأيمن (مضخة رقم 3) لتوفير تدفق إلى الأذين الأيمن. ضبط الضغط إلى ما يقرب من 3 ملم زئبقي. ضمان أن يتم تعبئة متنقلة مع وسائل الإرواء يقني؛ يدخل القنية الشريان الرئوي. تأكد من أن يمتلئ تماما مع قنية سائل الإرواء في حين يتم إدراجها لمنع فقاعات الهواء. خياطة للقنية إلى الشريان الرئوي. 4. إشارة شراء: الضغوط وإمكانات العمل حيد الطور، وfNADH مرة واحدة إقناء؛ إدخال القنية البطينين اكتمال إدراج بعناية القسطرة محول الضغط (ميلار) في الشريان الأورطي عن طريق قنية الأبهر. انتقل برفق الماضي في صمام الشريان الأورطي، والى الوقف. رصد إشارة الضغط المنخفض لضمان تحديد المواقع المناسبة من طرف القسطرة. ويرد مثال على الضغط المنخفضفي الشكل 1. اضغط بلطف على إمكانات العمل حيد الطور الكهربائي ضد النخاب البطين. رصد إشارة إلى تحقيق مناسب القياسات إمكانات العمل. طفيف قطعة أثرية الحركة في إشارة غير طبيعية. وضع قطب كهربائي ثنائي القطب التحفيز على الأذين الأيمن متهاديا إلى القلب. في بروتوكول لدينا، وكانت قلوب الخطى على طول دورة ما بين 300 و 150 ميللي ثانية، الموافق 200 و 400 نبضة في الدقيقة، على التوالي. قياس درجة حرارة سطح epicardial LV. إذا كانت الدراسة تقتضي أن يتم الحفاظ على درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية ثم ضع قلب داخل غرفة القلب المياه تغلف أو يغرق القلب في حمام superfusate حرارة للحفاظ على درجة حرارة ثابتة في جميع أنحاء القلب. وضع كاميرا CCD (Andor iXon DV860، 128×128 بكسل) وتركيز عدسة بحيث لوحظ حقل مناسب للعرض. يتم توصيل الكاميرا إلى محطة عمل، ويتم الحصول على الصور في 2 إطارا في الثانية باستخدام Andor SOLIS softwaإعادة. بدوره على ضوء مصباح الزئبق قبل بدء التصوير. يتم توجيه الضوء من خلال عامل تصفية إثارة (350 ± 25 نانومتر، وكروما والتكنولوجيا)، وإلى دليل ضوء الألياف البصرية (Horiba نموذج إيفون Jobin 1950-1M) لإلقاء الضوء على سطح القلب. توهين من الأشعة فوق البنفسجية من خلال دليل ضوء صغير. ويمكن أيضا أن توفر إضاءة الأشعة فوق البنفسجية باستخدام نظام الطاقة LED عالية مؤلفة من الأضواء الصمام (Mightex PLS-0365-030-S) وحدة التحكم (Mightex SLC-SA04 والولايات المتحدة). إيقاف ضوء الغرفة، والتقليل قدر الإمكان من الإضاءة المحيطة. وتهدف الحلقات من الدليل الضوء (أو أضواء LED) في قلب لتحقيق إضاءة epicardial موحدة. تنبعث NADH مضان (fNADH) يمر عبر فلتر الانبعاثات (460 ± 20 نانومتر التكنولوجيا كروما)، والتقط بواسطة كاميرا CCD. رصد التغيرات fNADH مع مرور الوقت من خلال اختيار المنطقة ذات الاهتمام باستخدام برنامج التصوير. حدد يعيش التحديث طريقة لرصد كثافة بكسل يعني داخل المنطقة سو الفائدة. يجب أن يكون يعمل في قلب البطينين طريقة العمل لتوليد الضغوط المناسبة. وينبغي أن تكون مستويات fNADH منخفضة ومستقرة على سطح epicardial لتأكيد نضح التاجي كاف. وينبغي في هذه المرحلة من الدراسة يتم تنفيذ بروتوكول معين تجريبية لاختبار الفرضية. عندما يتم الانتهاء من الدراسة، وإزالة القلب من النظام، واستنزاف كل سائل الإرواء. شطف الأنابيب وغرف مع نظام تنقية المياه. لأعمال الصيانة الروتينية، ينبغي للنظام تشطف دوريا مع حل Mucasol أو بيروكسيد الهيدروجين المخفف حل، حسب الحاجة. 5. خارج خط معالجة صور fNADH طريقة واحدة للمقارنة بين مجموعات البيانات NADH (fNADH (ط، ي، ر)) بين التجارب هو لتطبيع كل صورة مضان باستخدام صورة المرجعية (fNADH (ط، ي، ر 0)) من مجموعة البيانات 9، كما هو مبين في المعادلة التالية . طريقة أخرى لتطبيع NADH الاستشعاع إلى PLالآس قطعة صغيرة من الزجاج اليورانيل في مجال الرؤية أمام تجربة 9 و 18 و 19. سوف زجاج اليورانيل مضان (450 – 550 نانومتر) عندما مضيئة للأشعة فوق البنفسجية على تقديم إشارة والتي يمكن استخدامها كمرجع ثابت. 6. ممثل النتائج وترد وجهات النظر الأمامي والقاعدية من البطينين العمل أرنب إعداد قلب في الشكل 1. وتم قياس ضغط البطين الأيسر من خلال التنقل قسطرة محول الضغط (ميلار SPR-407) الماضي في صمام الشريان الأورطي، وإلى البطين الأيسر. وتظهر الضغوط البطين الأبهر، الشريان الرئوي، واليسار (LVP) في الشكل 1C. LVP الانبساطي عادة ما يكون بين 0 و 10 مم زئبق. الحد الأدنى للضغط الانبساطي الأبهر هو ما يقرب من 60 مم زئبق. قمة الانقباضي LVP يعتمد على ضغط التعبئة (والتحميل المسبق أو الضغط لوس انجليس) وانقباضو، على النحو الأمثل، ينبغي أن يكون ما بين 80 و 100 ملم زئبقي. ينبغي الضغط الأبهري الأقصى وLVP أقصى تطابق بشكل وثيق، كما هو مبين في الشكل 1C. وتظهر امكانات عمل حيد الطور (خرائط) مع مرحلة الاستقطاب السريع ومرحلة عودة الاستقطاب التي هي نموذجية للقلوب أرنب في 1D الشكل. يمكن تسجيل يتلخص بسهولة نسبيا من قلب المقاولات ولكن عادة ما يكون صغير قطعة أثرية خلال حركة المد، كما هو مبين في الشكل 1D. والخرائط هي مفيدة لتأكيد entrainment الناجح للقلب (التقاط) خلال سرعة ويمكن أن تستخدم أيضا لقياس التغيرات الكهربية المحلية بسبب نقص التروية أو الاضطرابات الحادة الأخرى. ويمكن أيضا لتخطيط القلب يمكن قياسها بواسطة غمر قلب في حمام دافئ من superfusate ووضع قطب كهربائي في الحمام على الجانبين الأيسر والأيمن من القلب. يتم وضعها إما القطب 3 غير مبال في الحمام، بعيدا عن القلب، أو هي التي تعلق على الشريان الأبهر.سيكون لتخطيط القلب تقدم معلومات عن الإثارة العالمية وعملية عودة الاستقطاب، وهو أمر مفيد لتقييم وظيفة الكهربائي الشامل والكشف عن وجود نقص التروية. fNADH التصوير يكشف عن تغيرات في ولاية الأكسدة الميتوكوندريا من القلب، والتي يمكن استخدامها لقياس مدى تقدم المكانية في المناطق الدماغية أو ميتة. لهذه الدراسة، تم قياس epicardial fNADH لرصد التغيرات في حالة الأكسدة خلال معدلات سرعة الثلاثة في أطوال دورة (CLS) من 300، 200، و 150 ميللي ثانية. متوسط القيم fNADH من منطقة من مصلحة (مربع أحمر، الشكل 2) تبين أن خط الأساس مستويات fNADH زيادة كما هو تقصير طول دورة. عندما يخطو معدل قريب من إيقاع الجيوب الأنفية (CL = 300 ميللي ثانية) خط الأساس fNADH مستوى ثابت نسبيا. كما تم تقصير مدة دورة أقل من 300 ميللي ثانية، زيادة مستويات خط الأساس fNADH، مع أكبر زيادة في أقصر CL (150 ميللي ثانية). ارتفاع القرار fNADH التصوير من سطح الأمامي كاملفي 200 و 400 نبضة في الدقيقة هو مبين في الشكل (3). وكانت مستويات fNADH في 200 نبضة في الدقيقة ثابتة ومتجانسة مكانيا. في 400 نبضة في الدقيقة، وزيادة مستويات fNADH كبير في جميع أنحاء النخاب. وقد لوحظ عدم التجانس المكاني كبيرة مع أكبر الزيادات التي تحدث داخل المناطق الحاجز من RV و LV. إشارة fNADH يتذبذب مع انكماش (قطعة أثرية الحركة) وتواتر التذبذب يتوافق مع معدل ضربات القلب (الشكل 2). إقناء؛ إدخال القنية في البطينين، ويقام في قاعدة للقلب بنسبة 4 حقنة عادية، مما يساعد على منع القلب من يتأرجح خلال الانكماش. ولذلك، التذبذب السعة أقل دائما من أي جدول زمني أطول (ثانية 5-10) الاتجاهات في fNADH التي تنتج عن نقص التروية أو نقص الأكسجة. الشكل 1. الضغوط النموذجية وإمكانات عمل حيد الطور من البطينين معزولة العمل RAbbit القلب. غادر 3، الأذيني؛؛ (1)، الشريان الأورطي، 2، و 4 الشريان الرئوي، الأذيني حق باء نظرا الأمامي للقلب تبين البطين الأيسر (LV) والبطين الأيمن: أ. رأي بصل للقلب تبين حقنة عادية 4. (RV) الضغوط الممثل. جيم. أعلى: اليسار الضغط البطيني (الخط المتصل) وضغط الشريان الأبهر (الخط المتقطع). أسفل: الضغط الرئوي D. امكانات الممثل عمل حيد الطور. يتم محاذاة إشارة مع الضغوط هو مبين في جيم لوحة انقر هنا لعرض أكبر شخصية . الشكل 2. fNADH التصوير من البطينين معزولة عمل قلب أرنب. أعلى: يتم عرض رسم كاريكاتوري للمجال الرؤية (يسار) وثلاث صور fNADH. يشار إلى أن دورة سرعة المقابلة طول (CL) على كل صورة.يشار إلى المنطقة من الفائدة للإشارة fNADH في لوحة أسفل بواسطة مربع أحمر. ويعتبر غيض من القطب عمل محتمل حيد الطور على يمين المنطقة من اهتمام. وكان مضيئة النخاب باستخدام مصباح الزئبق ودليل ضوء، كما هو موضح في الشكل 5. فقط كانت مضيئة على سطح epicardial المحيطة بالمنطقة من اهتمام السفلى:. fNADH يبلغ متوسط الأسعار في المنطقة من الاهتمام الذي أبدته مربع أحمر في لوحة أعلى. متوسط الزيادات fNADH مع طول دورة مخفضة. الشكل 3. صور fNADH من سطح الأمامي الكامل لعمل البطينين معزولة قلب أرنب. وكان قلب الخطى من التهاب المفاصل الروماتويدي في 200 نبضة في الدقيقة و 400 نبضة في الدقيقة. تم تصوير fNADH (2 إطارا في الثانية، 128×128 بكسل في القرار من 0.4 ملم)، في حين إلقاء الضوء على النخاب كامل الأمامية باستخدام اثنين من المصابيح عالية الطاقة (Mightex PLS-0365-030-S، 365 نيوتن متر، و 4٪ أناntensity، 50 ميغاواط كحد أقصى).

Discussion

قلب Langendorff معزولة perfused يظل أداة بارزة لدراسة علم وظائف الأعضاء في القلب ^2. انها مفيدة بشكل خاص في دراسات من عدم انتظام ضربات القلب، وخصوصا تلك التي تستخدم التصوير مضان من المحتمل عبر الغشاء ^20. ميزة هي التي يمكن ملاحظتها في النخاب كامل للقلب معزولة ^{21 و 22.} ميزة أخرى هي أنه، على النقيض من الدم، ونضح مع حل بلوراني العازلة واضحة لا تتداخل مع اشارات مضان. والقيد الذي لا تقنية Langendorff مناسبة تماما لدراسات التمثيل الغذائي في القلب، والتي تتطلب في كثير من الأحيان في قلب لأداء العمل في سياق التحميل المسبق الفسيولوجية والضغوط حمولة تلوية.

لرفع أهمية الاستعدادات قلب معزولة للدراسات التمثيل الغذائي، وعرض نيلي تعديلات على أسلوب Langendorff لإقامة مناسبة البطين الأيسر (LV) التحميل المسبق والضغوط حمولة تلوية ^3.ويعرف هذا النموذج بوصفه النموذج LV معزولة قلب العمل، واستخدمت على نطاق واسع لدراسة الوقف الأداء والتمثيل الغذائي ^{و 4-6.} قلب العمل LV نموذج متفوقة على نموذج Langendorff للتقييمات الفنية، إلا أنها لا توفر البطين تحميلها بشكل صحيح حق (RV). Demmy وآخرون. وذكرت لأول مرة نموذج البطينين (LV & RV)، وتعديل للقلب LV نموذج للعمل ^{7 و 8.} ووجد الباحثون ان تنمية حجم السكتة الدماغية، خرج القلب، وضغط تحسن في قلوب تحويلها من وضع LV العمل على وضع البطينين تعمل ^8. وRV تحميلها بشكل صحيح كما يحسن وظيفة الحاجز بواسطة تناقص التدرجات ضغط غير طبيعي عبر الحاجز. وقد ثبت البطينين قلوب العمل للحفاظ على الانتاج الأبهر، وتدفق الرئوي، يعني الضغط الأبهري، يعني الضغط الرئوي، ومعدل ضربات القلب وعضلة القلب للاعبي التنس المحترفين، ومستويات فوسفات الكرياتين لمدة تصل إلى 3 ساعات ^8. البطينين دراسات القلب يعمل عادة استخدام قلوب الابأم الحيوانات الصغيرة مثل الفئران والأرانب، وذلك لأن النتاج القلبي وحجم المطلوب من سائل الإرواء هي اقل بكثير من تلك التي للقلوب من الحيوانات الكبيرة. ومع ذلك، فقد أجريت دراسات البطينين قلب العمل باستخدام قلوب من الخنازير والكلاب، وحتى البشر ^{23 و 24.}

الطلب على التمثيل الغذائي للقلوب المعزولة في وضع العمل البطينين هو أعلى بكثير من تلك التي نضح Langendorff. من المهم أن الحل سائل الإرواء توفير ما يكفي من الأوكسجين والركيزة التمثيل الغذائي لدعم البطينين وظيفة القلب. معيار محاليل بلوراني، مثل كريبس، هنسلايت ^{16، 17، 25} أو Tyrodes ^{26، 27،} لديها درجات الذوبان الأكسجين تصل إلى 5.6 ملغ / لتر. عندما يتم بالغاز هذه الحلول مع كربوجين (مزيج من الغاز 95٪ O ₂ و 5٪ CO ₂₎ وتحتوي على الركيزة التمثيل الغذائي المناسب (الجلوكوز وسكر العنب، و / أو البيروفات الصوديوم)، فهي مناسبة لالبطينين قلوب العاملين في ضرب القاعدةشركة جيب المعدلات (حوالي 180 نبضة في الدقيقة لأرنب).

وقد تزايد الطلب على التمثيل الغذائي للإيقاعات سريعة وكمية الأوكسجين المذاب في perfusates معيار لا يكون كافيا لتقديم الدعم الكامل له قلب البطينين العمل التي يتم التعاقد على معدلات عالية. وقد استخدمت محاليل تحتوي على كريات الدم الحمراء بلوراني أو مختلطة مع الدم الكامل في قلب الاستعدادات العمل على ضمان توافر الأكسجين الكافي. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن إضافة كريات الدم الحمراء في التوصل إلى حل كريبس، هنسلايت تحسين عمل وظائف القلب خلال بروتوكولات سرعة صارم وخفضت أيضا من حدوث الرجفان البطيني ^16. وجود قيود على استخدام كرات الدم الحمراء أو خليط من الدم الكامل هو أن الهيموغلوبين يتداخل مع موجات الضوء التي يتم استخدامها لتصوير مضان ^13. ويمكن أيضا ركائز أخرى، مثل الزلال، يمكن ان تضاف الى سائل الإرواء حلول لإطالة أمد بقاء القلب وخفض وذمة ^28.

خلال التصوير مضان أن شدة الضوء الإثارة تكون عالية، وتوزيع الضوء وينبغي أن تكون موحدة. تحقيق إضاءة موحدة ليس من السهل دائما بسبب انحناء سطح epicardial. في دراستنا، ونحن fNADH الصورة عن طريق ترشيح ضوء (350 ± 25 نانومتر) من مصباح الزئبق. ويستخدم ذات الشعبتين دليل الألياف البصرية ضوء لتوجيه الأشعة فوق البنفسجية على سطح epicardial. لا يمكن أن يتحقق عن طريق الإضاءة موحدة لتحديد المواقع المناسبة لانتاج الحلقات اثنين. الصمام الأشعة فوق البنفسجية ويمكن أيضا أن تستخدم مصادر الضوء، كما بينا ذلك في الشكل 3. مصادر الصمام غير مكلفة نسبيا لذلك يمكن دمج مصادر متعددة في نظام التصوير. ويمكن أيضا أن يكون مدار المصابيح على نحو متقطع في معدلات عالية لمزامنة ضوء الإثارة مع الحصول على الصور.

وينبغي أن Photobleaching من NADH أن يكون الحد الأدنى ²⁹ عن طريق تقليل الوقت من الإضاءة الأنسجة. ويمكن القيام بذلك عن طريق ركوب الدراجات للإضاءة وإيقاف استخدام الإلكترونIC مصراع ومصباح أو مع نظام الإضاءة وجهاز تحكم. إذا تزامن مع إضاءة دورة القلب، ويمكن بعد ذلك أن يقتصر fNADH الحصول على الصور على انبساط، والتي من شأنها أن تقلل قطعة أثرية الحركة في الإشارات مضان. إضاءة Trigging والحصول على الصور باستخدام إشارة الضغط، مثل الضغط المنخفض، ستكون طريقة واحدة للقيام بذلك.

في دراستنا لاحظنا أن التغيرات في fNADH لكل وحدة زمنية يمكن أن يكون أكثر من 5X العالي في 400 نبضة في الدقيقة مما كان عليه في 200 نبضة في الدقيقة. هذا يشير إلى أن الإيقاعات السريعة رفع حالة الأكسدة في القلب. أم لا يحدث هذا من قبل نقص الأكسجة أو عدم قدرة myocytes لأكسدة NADH إلى NAD + بسرعة كافية لتفادي تراكم NADH لا تزال هناك مسألة لم يتم الرد عليها.

أداء إعداد البطينين قلب العمل يتوقف على عوامل متعددة. واحدة من أهم هو وضع مناسب التحميل المسبق وحمولة تلوية ضغوط لتقليد الفسيولوجيةالشروط التي هي قيد التحقيق. على وجه الخصوص، لا بد من ضبط حمولة تلوية LV (ضغط الشريان الأبهر) لتمثيل ضغط النظامية. إذا كانت عالية جدا، فإن الوقف لن تكون قادرة على التغلب على الضغط، مما أدى إلى قلس. وضغط منخفض للغاية أن تؤثر سلبا على التروية التاجية. وينبغي أيضا للضغط التحميل المسبق LV (الضغط الأذيني اليسار) يمكن تعديلها لتوفير حجم نهاية الانبساط هذا هو المناسب للبروتوكول تجريبي.

fNADH التصوير من الأنسجة الحية هو النمط الثابت من التصوير مضان ^13. وقد تجلى تطبيقه على أنسجة القلب من قبل بارلو وفرصة عندما ذكرت الارتفاعات ضرب fNADH داخل الأنسجة الدماغية إقليميا بعد ربط وجود ¹⁴ سفينة التاجية. وسجلت صورهم fNADH على الفيلم باستخدام كاميرا الذبذبات فيرتشايلد والأشعة فوق البنفسجية والتصوير الفوتوغرافي فلاش. Coremans وآخرون. توسعت على هذا المفهوم باستخدام نسبة NADH الانعكاس مضان / الأشعة فوق البنفسجية لقياس آثافةه الدولة التمثيل الغذائي للالنخاب من قلوب الفئران Langendorff الدم perfused ^30. وقد استخدم videofluorimeter للتصوير وسجلت البيانات باستخدام جهاز الفيديو. في وقت لاحق، شولتس وآخرون. تستخدم مجموعة وطيف والثنائي الضوئي لقياس fNADH متوسط من منطقة واسعة من LV. خفضت هذا النهج آثار التغاير مضان epicardial والاختلافات المحلية في التداول في الوقت الذي يكشف العيانية ذات الصلة بالعمل اختلافات fNADH ^31. هذا النهج هو مماثل لمستويات الحوسبة fNADH المتوسط للمنطقة من اهتمام في جميع الأطر من مجموعة البيانات التصوير fNADH، كما هو موضح في الشكل رقم 2. كما قدمناه في هذه المادة، والتكنولوجيا اليوم يوفر سرعة عالية الكاميرات اتفاقية مكافحة التصحر والتحكم فيها رقميا الأضواء فوق البنفسجية عالية الطاقة. هذه التقنيات تمكن من دراسة الديناميات المكانية من fNADH والتمثيل الغذائي في القلب من وجهات نظر جديدة كثيرة. ومنخفض التكلفة نسبيا للبصريات ومصدر للضوء و يجعلNADH التصوير ملحق مفيدة لرسم الخرائط التقليدية القلب النظم البصرية. ^{9، 32}

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل عن طريق منحة من المعاهد الوطنية للصحة (R01-HL095828 إلى كاي ميغاواط).

Materials

Chemical	Company	Catalogue Number
NaCl	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	S-3014
KCl	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	P3911-500G
CaCl₂	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ	C77-500
MgSO₄	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	M-7506
NaHCO₃	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ	S-233
KH₂PO₄	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ	423-316
Glucose	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	158968-500G
NaPyruvate	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	P2256-25G
Albumin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A9418-100G

Referanslar

Langendorff, O. Untersuchungen am uberlebenden saugethierherzen [investigations on the surviving mammalian heart]. Arch. Gesante Physiol. 61, 291-332 .
Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to langendorff—still viable in the new millennium. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 55, 113-126 (2007).
Neely, J. R., Liebermeister, H., Battersby, E. J., Morgan, H. E. Effect of pressure development on oxygen consumption by isolated rat heart. Am. J. Physiol. 212, 804-814 (1967).
Feng, H. Z., Jin, J. P. Coexistence of cardiac troponin T variants reduces heart efficiency. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299, H97-H105 (2010).
Clemens, M. G., Forrester, T. Appearance of adenosine triphosphate in the coronary sinus effluent from isolated working rat heart in response to hypoxia. J. Physiol. 312, 143-158 (1981).
Cole, M. A., Murray, A. J., Cochlin, L. E., Heather, L. C., McAleese, S., Knight, N. S., Sutton, E., Jamil, A. A., Parassol, N., Clarke, K. A high fat diet increases mitochondrial fatty acid oxidation and uncoupling to decrease efficiency in rat heart. Basic Res. Basic Res. Cardiol. 106, 447-457 (2011).
Demmy, T. L., Curtis, J. J., Kao, R., Schmaltz, R. A., Walls, J. T. Load-insensitive measurements from an isolated perfused biventricular working rat heart. J. Biomed. Sci. 4, 111-119 (1997).
Demmy, T. L., Magovern, G. J., Kao, R. L. Isolated biventricular working rat heart preparation. Ann. Thorac. Surg. 54, 915-920 (1992).
Kay, M., Swift, L., Martell, B., Arutunyan, A., Sarvazyan, N. Locations of ectopic beats coincide with spatial gradients of NADH in a regional model of low-flow reperfusion. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 2400-2405 (2008).
Swift, L., Martell, B., Khatri, V., Arutunyan, A., Sarvazyan, N., Kay, M. Controlled regional hypoperfusion in langendorff heart preparations. Physiol. Meas. 29, 269-279 (2008).
Kay, M. W., Swift, L. M., Sangave, A., Zderic, V. High resolution contrast ultrasound and NADH fluorescence imaging of myocardial perfusion in excised rat hearts. , 1-4 (2008).
Chance, B. Pyridine nucleotide as an indicator of the oxygen requirements for energy-linked functions of mitochondria. Circ. Res. 38, I31-I38 (1976).
Mayevsky, A., Rogatsky, G. G. Mitochondrial function in vivo evaluated by NADH fluorescence: From animal models to human studies. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 292, C615-C640 (2007).
Barlow, C. H., Chance, B. Ischemic areas in perfused rat hearts: Measurement by NADH fluorescence photography. Science. 193, 909-910 (1976).
Mayevsky, A., Chance, B. Oxidation-reduction states of NADH in vivo: From animals to clinical use. Mitochondrion. 7, 330-339 (2007).
Gillis, A. M., Kulisz, E., Mathison, H. J. Cardiac electrophysiological variables in blood-perfused and buffer-perfused, isolated, working rabbit heart. Am. J. Physiol. 271, H784-H789 (1996).
Ôta, K., Peaker, M. Lactation in the rabbit: Mammary blood flow and cardiac output. Experimental Physiology. 64, 225-238 (1979).
Ashruf, J. F., Ince, C., Bruining, H. A. Regional ischemia in hypertrophic langendorff-perfused rat hearts. Am. J. Physiol. 277, H1532-H1539 (1999).
Ashruf, J. F., Coremans, J. M., Bruining, H. A., Ince, C. Increase of cardiac work is associated with decrease of mitochondrial NADH. Am. J. Physiol. 269, 856-862 (1995).
Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ. Res. 95, 21-33 (2004).
Rogers, J. M., Walcott, G. P., Gladden, J. D., Melnick, S. B., Kay, M. W. Panoramic optical mapping reveals continuous epicardial reentry during ventricular fibrillation in the isolated swine heart. Biophys. J. 92, 1090-1095 (2007).
Qu, F., Ripplinger, C. M., Nikolski, V. P., Grimm, C., Efimov, I. R. Three-dimensional panoramic imaging of cardiac arrhythmias in rabbit heart. J. Biomed. Opt. 12, 044019 (2007).
Chinchoy, E., Soule, C. L., Houlton, A. J., Gallagher, W. J., Hjelle, M. A., Laske, T. G., Morissette, J., Iaizzo, P. A. Isolated four-chamber working swine heart model. Ann. Thorac. Surg. 70, 1607-1614 (2000).
Hill, A. J., Laske, T. G., Coles, J. A., Sigg, D. C., Skadsberg, N. D., Vincent, S. A., Soule, C. L., Gallagher, W. J., Iaizzo, P. A. In vitro studies of human hearts. Ann. Thorac. Surg. 79, 168-177 (2005).
Schenkman, K. A. Cardiac performance as a function of intracellular oxygen tension in buffer-perfused hearts. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 281, H2463-H2472 (2001).
Pijl, A. J., Pfaffendorf, M., Mathy, M., Van Zwieten, P. A. Cardioprotection by nifedipine in isolated working hearts: A comparative study on three different types of experimental ischemia. J. Cardiovasc. Pharmacol. 21, 70-76 (1993).
Khatib, S. Y., Boyett, M. R. Effects of glyburide (glibenclamide) on myocardial function in langendorff perfused rabbit heart and on myocardial contractility and slow calcium current in guinea-pig single myocytes. Mol. Cell Biochem. 242, 81-87 (2003).
Kates, R. E., Yee, Y. G., Hill, I. Effect of albumin on the electrophysiologic stability of isolated perfused rabbit hearts. J. Cardiovasc. Pharmacol. 13, 168-172 (1989).
Combs, C. A., Balaban, R. S. Direct imaging of dehydrogenase activity within living cells using enzyme-dependent fluorescence recovery after photobleaching (ED-FRAP). Biophys. J. 80, 2018-2028 (2001).
Coremans, J. M., Ince, C., Bruining, H. A., Puppels, G. J. (Semi-)quantitative analysis of reduced nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence images of blood-perfused rat heart. Biophys J. 72, 1849-1860 (1997).
Scholz, T. D., Laughlin, M. R., Balaban, R. S., Kupriyanov, V. V., Heineman, F. W. Effect of substrate on mitochondrial NADH, cytosolic redox state, and phosphorylated compounds in isolated hearts. Am. J. Physiol. 268, 82-91 (1995).
Holcomb, M. R., Woods, M. C., Uzelac, I., Wikswo, J. P., Gilligan, J. M., Sidorov, V. Y. The potential of dual camera systems for multimodal imaging of cardiac electrophysiology and metabolism. Exp. Biol. Med. (Maywood). 234, 1355-1373 (2009).

Etiketler

NADH Fluorescence Imaging Isolated Perfused Heart Langendorff Technique Cardiac Physiology Cardiac Metabolism LV Working Heart Model Biventricular Model Stroke Volume Cardiac Output Pressure Development Myocardial Injury Ischemia NADH Fluorescence

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Bu Makaleden Alıntı Yapın

Asfour, H., Wengrowski, A. M., Jaimes III, R., Swift, L. M., Kay, M. W. NADH Fluorescence Imaging of Isolated Biventricular Working Rabbit Hearts. J. Vis. Exp. (65), e4115, doi:10.3791/4115 (2012).