Due metodi di Formazione Heterokaryon per scoprire fattori di restrizione HCV

Virus dell'epatite C (HCV) è un virus epatotropi con un host-range limitato per gli esseri umani e scimpanzé. Sebbene la replicazione di HCV RNA è stata osservata in linee cellulari umane non epatiche e murino, l'efficienza era molto basso e necessarie a lungo termine utilizzando procedure di selezione HCV replicone costruisce esprimere dominanti antibiotico-marcatori selezionabili ^1-5. HCV in vitro ricerca è quindi limitato a linee cellulari umane di epatoma permissive per entrata del virus e completamento del ciclo vitale del virus. Grazie alla stretta HCVs tropismo specie, non esiste un modello immunocompetenti piccolo animale a disposizione che sostiene l'intero ciclo di replicazione di HCV ^6-8. Inefficiente replicazione di HCV in cellule di origine murina esempio non umani è probabilmente dovuto alla mancanza di incompatibilità genetica di fattori essenziali dipendenza ospite e / o espressione di fattori di restrizione.

Abbiamo studiato se la propagazione è soppresso da HCV fa restrizione dominantectors sia in linee cellulari umane derivate da tessuti non-epatiche o in linee di cellule di fegato di topo. A tal fine, abbiamo sviluppato due indipendenti condizionali trans-complementazione I metodi basati sulla fusione di cellule somatiche. In entrambi i casi, il completamento del ciclo di replicazione virale è possibile solo nelle eterocarionti. Di conseguenza, successo trans-complementazione, che è determinata misurando la produzione de novo di progenie virale infettivo, indica l'assenza di limitazioni dominanti.

In particolare, subgenomici repliconi HCV trasportano un transgene luciferasi sono stati trasfettati in cellule permissive altamente epatoma umano (7,5-Huh cellule). Successivamente, queste cellule sono state co-coltivate e fuse a varie cellule umane e murine esprimono proteine ​​HCV anima strutturale, busta 1 e 2 (E1, E2) e accessorio proteine ​​NS2 e P7. Purché la fusione cellulare è stata iniziata mediante trattamento con polietilene-glicole (PEG), la coltura rilasciato virale infettivo paARTICOLI che le cellule infettate naïve in un recettore-dipendente.

Per valutare l'influenza delle restrizioni dominanti sul ciclo di vita virale, compresa l'iscrizione delle cellule, la traduzione RNA, la replicazione del virus e l'assemblaggio, abbiamo approfittato di una linea cellulare umana fegato (Huh-7 Lunet N celle ^9), che manca l'espressione endogena di CD81, un fattore essenziale ingresso di HCV. In assenza di ectopicamente CD81 espresso, queste cellule sono essenzialmente refrattari a infezione da HCV ^10. È importante sottolineare che, quando co-coltura e fuse con cellule che esprimono CD81 umano, ma la mancanza di almeno un altro fondamentale fattore di cella (cioè SR-BI, CLDN1, OCLN), solo i eterocarionti risultanti visualizzare l'insieme completo dei fattori di ingresso necessari per l'infezione da HCV. Pertanto, per analizzare se fattori di restrizione dominanti sopprimere completamento del ciclo di replicazione di HCV, si fuse Lunet N celle con varie cellule di origine umana e di topo che soddisfano il critico suddettoeria. Quando co-coltura di cellule sono state transfettate con una proteina altamente fusogenico virale mutante del virus schiumoso prototipo (PFV ¹¹⁾ e successivamente contestata con particelle infettive (HCV HCVcc), la produzione de novo del virus infettivo è stato osservato. Ciò indica che HCV completato con successo il suo ciclo di replica in eterocarionti escludiamo quindi l'espressione di fattori di restrizione dominanti in queste linee cellulari. Questi nuovi condizionali trans-complementazione metodi saranno utili a programmare una grande pannello di linee cellulari e cellule primarie per l'espressione di HCV-specifici fattori di restrizione dominanti.