Микрофлюидных Смесители для изучения сворачивания белков

1. Изготовление микрофлюидных смешивания фишки На рисунке 3 показаны основные этапы производства. Очистите 4 дюйма (100 мм) пластин кремния плавленого свежим раствором Piranha (3:1 H 2 SO 4: H 2 O 2): а) тепло серной кислоты до 130 ° С, затем влить в перекиси водорода. Обратите внимание, что шероховатость поверхности и плоскости расплавленного пластин кремния использовались играют важную роль для окончательного шага связи. II) Погрузите пластин, по крайней мере 30 минут. III), промыть в течение 5 минут с водой и сухим. Применение поликристаллического кремния (поли) покрытием, ~ 1 мкм на каждый предназначены 10 мкм глубина окончательный микрофлюидных каналов, с помощью низкого давления, химического осаждения паров (LPCVD) печи. Очистите пластины и маску, используя протокол Piranha в шаге 1.1. Очистите маску, так же, затем смойте ацетон, метанол и изопропанол и сушить немедленно. Высушить пластин на горячей плите на 150 ° С в течение ~ 10 минут (использовать палатку алюминиевой фольгой, чтобы частицы езды) или 120 ° С духовке в течение по крайней мере, 120 мин (на ночь предпочтительнее). Для увеличения адгезии фоторезиста, сразу же подвергать теплые вафли в HMDS пар в течение 5 минут. Спин покрытие пластин с ~ 900 нм слоем фоторезиста AZ5214 и мягкие выпекать при температуре 90 ° C непосредственно на плите в течение 1 минуты или в духовке при 110 ° С в течение 30 мин (рис. 3, п. 1). Совместите маску и принять нелегкое и отсоса воздуха. Подвергать воздействию ультрафиолетового излучения в течение нескольких секунд (полная энергия: ~ 103 мДж / см 2) (рис. 3, п. 2). Разработать с AZ400K разработчик, разбавляют водой 4:01 DI на ~ 50 секунд (пока фоторезист полностью разработан), а мягко агитацию. Промыть водой в течение 2 минут. Проверьте черт с микроскопом (рис. 3, пункт 3). Если функции плохо решена, лишить фоторезиста и начните снова с 1.2. Жесткий выпекать 115 ° C непосредственно на плите в течение 2минут. Descum вафли с Ашер или O 2 плазмы в течение 2,5 минут при 100 Вт мощности РФ. С помощью глубокого реактивного ионного гравер (DRIE), травления поликремния слой на всем пути до плавленого кварца ниже. Снимите оставшийся фоторезист с PRS2000 противостоять зачистки при 75 ° С в течение 10 минут. Промойте и высушите. Измерить глубину травления, чтобы обеспечить это все путем поли покрытием (рис. 3, п. 4). Использование оксида способны DRIE таких как ULVAC НЛД-6000 гравер, травления кварцевого стекла на глубину ~ 10 мкм на микрон толщины покрытия пола (рис. 3, шаг 5). Это покрытие пола будут стерты во время травления, так что может быть необходимо, чтобы проверить целостность покрытия периодически во время процесса травления. Если намеренно безликие районы поверхности пластины стали голые защитные покрытия пола в процессе травления, поверхность, скорее всего, стали без косточек и больше не подходит для склеиванияВ заключительных этапах производства. В этом случае пластины, скорее всего, больше не жизнеспособна. Очистите с матрицей Ашер в течение 4 минут, 100 Вт ВЧ-мощность. Снимите поликремния с XeF 2 гравер (рис. 3, пункт 6). Это может быть необходимо повторить шаг 1,4 и этот шаг несколько раз, чтобы удалить все фоторезиста и поли покрытий. Спиновая слой пластины с новыми ~ 1 мкм слой фоторезиста для защиты каналов во время последующей обработки. Просверлите входа и выхода отверстия в каждом чипе с помощью компьютера управлять алмазные сверла или вручную с помощью пескоструйного аппарата (рис. 3, пункт 7). Если с помощью сверла, установите пластину (функция стороной вниз) на жертвенный стекло использованием Аква Бонд 55, заботясь, чтобы сохранить полуторный без пузырьков. Охладите дрель с микро-90 чистящий раствор. Это делает небольшие кусочки стекла от прилипания к каналам, которые затем забивают чипа во время использования. Промыть пластины с DI воды с помощью шприца вводят WВодный в каждое отверстие. Замочите в мыльной воде в течение часа. Удаление фоторезиста и Аква Бонда с PRS 2000 года 60 ° С в течение нескольких часов, пока поверхность была чистой. Промыть пластины с DI воды и теплой мыльной воде. Промыть каждую лунку снова с помощью шприца, избегая травления особенности. Сухие пластины с азотом и в вакуумную печь установлена ​​в 120 ° C. Осмотрите отверстия, чтобы обеспечить их свободный песка и повторить очистку шаги по мере необходимости. Измерить глубину каналов либо с оптическим или механическим поверхности профилирования (рис. 3, шаг 8). Чистая пластин и такое же количество 170 мкм плавленого стекла крышка кремнезема 1) Piranha решение (1-2 часов в соответствии с процедурой, описанной в 1.1), 2) RCA 2 (5:01:01 DI: HCl: H 2 0 2 ) решение в течение 10 минут при температуре 75 C, 3) RCA 1 решение (5:01:01 DI: NH 4 OH: H 2 0 2) в течение 22 минут при 75C). Промыть водой DI в течение 5 минут между каждым решением. Поместите один особенности пластины вверх на вершинуСтек 3-4 салфетки чистых помещений размещены в верхней части твердую плоскую поверхность, например, небольшой стекло. Сухие пластины полностью с азотом, по крайней мере 5 минут. Повторите с остеклением. Поднимите крышку стекла края и перевернуть так, что полированной стороной вниз, проведенных за пластины и выравнивания плоских краях. Аккуратно опустить крышку стекла на подложке и дайте ему отстояться. Сдвинуть только по горизонтали, чтобы настроить выравнивание. Надавите пальцем на центр пластины. Надо было видеть перед связи начинают излучать наружу. В случае необходимости, применить дополнительное давление на другие должности около пластины для продвижения связей передних (рис. 3, пункт 9). Поместите запечатанном пластин в печи высокой температуры, установленной нарастить от комнатной температуры до 800 ° С в течение 3 часов, то от 800 – 1100 ° C в течение еще 1,2 часа. Держите при температуре 1100 ° С в течение 2 часов, а затем нарастить до комнатной температуры в течение еще 1,5 часа. Кости с пластины перетасовки видел я вndividual чипов (рис. 3, пункт 10). В протоколе описывается изготовление каналов в довольно необычной плавленый кварц субстрата, необходимого для обнаружения УФ. Но этот протокол также может быть адаптирована к кремниевой подложке, которая требует только одного травления шаге 2. Стекла (но не плавленный кварц) покровного стекла могут быть связаны с использованием пластин анодной связи. 2. Установка и загрузка фишки Многообразие проводить смешение Чип и решения могут быть выполнены из пластика, таких, как Lexan или оргстекла или алюминия для регулирования температуры (рис. 4). При использовании алюминия, решение резервуары должны быть покрыты Parylene для предотвращения растворения алюминия в растворах солей в водоемы. Температура всего многообразия решений и чип можно управлять с помощью термоэлектрического устройства, установленные по бокам и электронный контроллер. Чип в паре с манираз малые кольца и удерживается на месте с стопорного кольца, что позволяет четко оптический вид на центр чипа. Уплотнительное кольцо пазы должны быть мельче, чем стандартные для обеспечения хорошего брачного без применения слишком большого давления на чип, то есть 002 уплотнительное кольцо должно быть 0,025 "глубоко. Когда чип установлен, добавить решения в центре и боковых резервуаров , заботясь, чтобы освободить всех захваченных пузырьков в нижней части скважины. Потому что объемы, используемые в этом смесителе настолько малы, поток можно управлять с помощью давления воздуха применяется над раствором скважины. На рисунке 4 показана напорный коллектор в паре с верхней части чипа многообразия уплотнительные кольца. Напорный коллектор соединен с компьютерным управлением датчики давления, которые могут поддерживать давление от ~ 2-80 PSI. Чип был разработан так, что равное давление на центр и боковые каналы производят ~ 100 раз соотношение в линейных скоростях потока. На 20 PSI, линейная скорость потока на выходе канала ~ 1 м/ С. Поместите многообразия на инвертированный микроскоп и изучить смешение региона окуляр или изображения с камеры. Лампы фонарика размещены в верхней части коллектора обеспечит достаточное количество света. Использование красителя или высокий показатель преломления раствора (т.е. 6 М гуанидина гидрохлорид) в центральный канал, чтобы посмотреть струи. При равном давлении в центре и боковых каналов, струя будет трудно увидеть, так что глаза начинают с напорной стороны канала 0 PSI и медленно увеличивать на равный давлению. Если одна из сторон канала забиты, струя будет толкнул одну из стен выхода канала. Если видимые помехи Оказывается, это может быть выбит, применяя давление или вакуум к выходу канала с помощью шприца. Если белка или других органических материалов забивает чип, он может быть очищен путем замачивания в растворе Pirhana ночь. 3. Сбор данных На рисунке 5 показана основная оптическая схема прибора. Возьмите с собой коллимированный лазерный луч в научно-класс микроскоп помощью дихроичных зеркала внутри или в непосредственной близости от микроскопа. Совместите лазер так, чтобы фокус можно увидеть в окуляр камеры или несколько рядом смешения региона. Флуоресценции белка в смеситель собраны объективные и передается через дихроичных зеркала, фокусируется линзой в отверстие и отображается на счетчик фотонов. Сканирование чипов с помощью пьезоэлектрических сканера в х и у изображения смешения области (типичный размер шага составляет 2 мкм). Выберите позицию по струе и сканирования в х и г найти фокус по центру канала по вертикали. Глубина резкости микроскопа значительно меньше глубины канала и расход равномерно в канале, за исключением в 1 мкм стен. Таким образом, временное разрешение наблюдаемой флуоресценции определяется прежде всего размером конфокальной месте. Сканирования по горизонтали в выходном канале (типичный шаг сИзе составляет 0,2 мкм поперек струи, 2 мкм вдоль струи) в 100 мкм шагом вдоль струи, наблюдая за ~ 1 мс в положение (см. рисунок 6). Перемещение столика микроскопа на 80-90 мкм вдоль струи, чтобы захватить более поздние времена. Кроме того, свет может быть обнаружена с помощью спектрографа и ПЗС после дихроичных зеркала с помощью линзы для фокусировки света на входной щели. Поскольку сбор данных происходит медленнее, чем на счетчик фотонов (1 секунда в положении), как правило, струи отображаемого сначала счетчик фотонов, а затем точки вдоль струи измеряется с спектрографа (см. Рисунок 7). Данные счетчика фотонов анализируется путем суммирования 3-5 пикселей вокруг струи на каждой позиции для создания сюжета интенсивности от расстояния. Время рассчитывается исходя из расстояния с использованием рассчитанных скоростей на основе приложенных давлений (см. рисунок 8). Данные спектрографа можно проанализировать несколько способов. Для FRET, каналLs обозначены как «донор» и «акцептором» может каждый суммируются и близость соотношение E = I / (I + D I D), рассчитанный (см. Рисунок 9). Кроме того, одно разложение значения могут быть выполнены, чтобы посмотреть на независимых спектральных компонент в зависимости от времени, такие как сдвиг в спектре излучения триптофана, как белка складки. Расстояние в выходном канале может быть преобразован в время, используя постоянную скорость потока определяется из приложенного давления в сторону канала. В течение первых 2 мкм на выход канала, расход белка ускоряет струю ~ 100х и время в этом регионе должны быть рассчитаны с анализа методом конечных элементов тока (производство времена приведены на рисунке 8). Это ускорение вызывает смещение ~ 1-2 мкс после скорости становится постоянным и, как правило, игнорируются при измерении кинетики гораздо медленнее, чем перемешивание. 4. Представитель Результаты На рисунке 6 показан контур участка интенсивности в области смешения измеряется счетчик фотонов. Фона в выходном канале вне струи должны быть близки к шумов детектора и, как правило, не вычитаются. Выше фона может свидетельствовать о плохой выравнивания или, что белок придерживается стенки канала. Струи, которая выглядит перегибов или криво, особенно вблизи смешивания регионе, указывает на плохой травления из сопла. На рисунке 7 показана время разрешенные спектры от белка ацил-коэнзим А-связывающий белок (ACBP) помечены Alexa Alexa 488 и 647. Эти данные были вычтены фон для удаления темных заряда и лазерный сигнал. Фонового сигнала было принято с давлением центрального канала установлен в 0 PSI. Время перемешивания может быть измерена с помощью измерения быстрого реагирования, что значительно быстрее, чем смешение таких как тушение флуоресценции Trp бу К.И. или крах одноцепочечной ДНК, меченные FRET-красителей, при добавлении NaCl. Поскольку струя меньше, чем оптическое разрешение микроскопа, существует большое падение интенсивности перемешивания региона струи формы. Этот инструмент ответ может быть удалена путем контрольного измерения, в которых без изменения решение условиях. На рисунке 8 показано соотношение смешивания (в 400 мМ KI) и несмешивающихся эксперименты N-ацетил флуоресценции амид триптофан. Линия показывает предсказанные концентрации К.И. из COMSOL моделирования. Время перемешивания, измеренная как время для концентрации на снижение 80%, 8 мкс. Так как данные, собранные в 100 мкм шагом по 500 мкм длиной выход канала, данные должны быть склеены из нескольких представлений. Есть иногда небольшие смещения сигнала между этими взглядами, вероятно, из-за небольших изменений в фокусе чип перемещается столик микроскопа. Перемещая стадии 80 или 90мкм на взгляд, эти смещения могут быть устранены путем исследования перекрывающихся данных. Обычно данные собираются, по крайней мере двум показателям расхода и данные объединяются для подтверждения любой сигнал изменения связаны с реальной спектроскопические изменения в белке, а не оптический или поток эффектов. На рисунке 9 показано лад изменения в белке ACBP после разбавления денатурации от 6 м до 0,06 М. Эти данные не нужен контрольный эксперимент с лада уже отношение и инструмент ответ уже удален. Быстрый скачок вблизи T = 0 представляет собой быстрое изменение FRET-сигнала в пределах времени перемешивания. Рисунок 1. Схема смешивания области измеряется с помощью электронного микроскопа. Рисунок 2. Схема смешивания гидродинамическим изучения сворачивания белков. Белка,растворяется в высоком денатуранта развернуть его, стекает вниз по центральному каналу в направлении смешения регионе, где она встречается буфера текущей ~ 100 раз быстрее. Ламинарного потока заставляет белок поток в узкий струи из которых денатурации молекулы могут быстро диффундируют. Как струя течет вниз по выходному каналу, белок можно наблюдать с высоким пространственным и временным разрешением помощью конфокальной микроскопии. Рисунок 3. Изготовление плавленого кварца. 1) Процесс начинается с полированной 500 мкм плавленый подложки диоксида кремния (а) в слое поликристаллического кремния (поли), нанесенных на верхней и нижней поверхностей (б) и спин-покрыта слоем фоторезиста (с). 2) фотошаблонов (е) принес Int о жестком контакте с подложки и фоторезиста подвергается воздействию ультрафиолетового излучения (г). 3) пластина помещается в ванну и разработчик модели проявляется в фоторезиста. 4) пластина помещается в DRIE и особенности выгравированы в верхней поли покрытием. Фоторезиста удаляется. 5) поли затем действует в качестве маски, когда пластина помещается в оксид гравер и особенности травления 10 – 40 мкм на подложке плавленого кварца. 6) поли покрытие удаляется в XeF 2 гравер. 7) пластины связаны с жертвенной стекло с тепло-активированной герметик (г), особенности стороной вниз, и немного алмазного бурения (е) абразивно сверла сквозные отверстия с тыльной стороны. 8) поверхность профилирования (ч), то непосредственно измеряет глубину травления функцию. 9) A 170 мкм плавленый кварц пластины покровным непосредственно связан с верхней поверхности пластины. 10) пластины на отдельные кубики микрожидкостных чипов. 3976/3976fig4.jpg "/> Рисунок 4. Смеситель многообразии. Микрофлюидных-чип крепится к решению многообразие с обработанной лицевой панели алюминием и четыре уплотнительные кольца при ~ 200 мкл водоемов. Большое отверстие обрабатывается через центр многообразия непосредственно над смешивания области прикреплены микрофлюидных-чип, позволяющий избыток ультрафиолетового света бежать без обратного рассеяния, подавляя любые авто-флуоресценции от самого многообразия и предоставления прямого освещения чип на глаз или камеры для выравнивания. Воздушный коллектор уплотнения каждого из водохранилищ, что давление воздуха в каждой можно управлять с помощью внешнего устройства регулирования давления. Рисунок 5. Схема оптической конфокальной микроскопии. Рисунок 6. Контур участок триптофанафлуоресценции в микрофлюидных смесителя. Смешение область расположена на ~ 90 мкм на оси ординат. Рисунок 7. Зависит от времени флуоресцентные спектры собранных в смеситель. Зеленые и красные столбики длиной волны назначенного в качестве донора и акцептора каналов, соответственно. Рисунок 8. Смешивание время, измеряемое тушение флуоресценции триптофана калия йодида (точки и правая шкала) и рассчитанные на анализ методом конечных элементов (линии, левая ось). Рисунок 9. FRET-изменения измеряются в процессе сворачивания белков ACBP. Быстрый рост вблизи Т = 0 представляет собой взрыв в фазе смешения времени и медленный рост представляет собой постепенное накоплениеТион структуры в качестве белкового складки. Данные, принятые на двух разных скоростях потока и обложил, что приводит к различной плотности измерений в разное время.