Агарозном геле для разделения фрагментов ДНК

Агарозном гель-электрофореза оказался действенным и эффективным способом разделения нуклеиновых кислот. Высокая прочность геля агарозы позволяет при обращении с низким процент гели для отделения больших фрагментов ДНК. Молекулярные сита определяется размер пор порожденных пучками агарозном ⁷ в матрице геля. В общем, чем выше концентрация агарозы, тем меньше размер пор. Традиционные гели агарозы являются наиболее эффективными на разделение фрагментов ДНК от 100 б.п. и 25 кб. Чтобы выделить фрагменты ДНК размером более 25 кб, надо будет использовать импульс поле гель-электрофореза ^6, который предусматривает применение переменного тока от двух разных направлениях. Таким образом, более крупные фрагменты ДНК разделяются по скорости, с которой они переориентируются с изменением направления тока. Фрагменты ДНК менее 100 б.п. более эффективно разделяются с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. В отличие отагарозном геле, матрица полиакриламидном геле формируется за счет свободных радикалов управляемой химической реакции. Эти тонкие гели имеют более высокую концентрацию, стоят вертикально и имеют более высокое разрешение. В современном секвенирования ДНК капиллярного электрофореза используются, в результате чего капилляры наполняются гель матрицы. Использование капилляров позволяет применение высоких напряжений, что позволяет разделения фрагментов ДНК (и определения последовательности ДНК) быстрее.

Агарозы может быть изменен для создания низкой температурой плавления агарозы через гидроксиэтилирования. Низкий плавления агарозы, как правило, используется при выделении отдельных фрагментов ДНК лучшего. Гидроксиэтилирования уменьшает плотность упаковки пучки агарозы, эффективно уменьшая их размер пор ^8. Это означает, что фрагмент ДНК одного и того же размера потребуется больше времени для перемещения по низкой температурой плавления агарозном геле, в отличие от стандартных агарозном геле. Поскольку пучки связывают друг с другомчерез нековалентных взаимодействий ^9, можно повторно расплавить агарозном геле после его установки.

EtBr является наиболее распространенным реагента, который используется для окрашивания ДНК в агарозном геле ^10. Под воздействием ультрафиолетового излучения, электроны в ароматическое кольцо молекулы этидия активизируются, что приводит к освобождению энергии (света), а электроны возвращаются на землю государства. EtBr работает интеркалирующих себя в молекуле ДНК в зависимости от концентрации. Это позволяет для оценки количества ДНК в той или иной группы ДНК на основе его интенсивности. Из-за его положительного заряда, использование EtBr снижает скорость миграции ДНК на 15%. EtBr является подозреваемым мутагенным и канцерогенным, поэтому нужно проявлять осторожность при обращении с агарозном гелей, содержащих его. Кроме того, EtBr считается опасным отходам и должны быть утилизированы надлежащим образом. Альтернативные пятна ДНК в агарозном геле включает SYBR золото, SYBR зеленый, фиолетовый кристалл и метил синий. Из нихМетил синий и фиолетовый кристалл не требует воздействия геля к ультрафиолетовому излучению для визуализации ДНК групп, тем самым снижая вероятность мутации, если восстановление фрагмента ДНК из геля требуется. Однако их чувствительность ниже, чем у EtBr. SYBR золота и SYBR зеленый являются высокочувствительными, УФ-зависимый красители с более низкой токсичностью, чем EtBr, но они значительно дороже. Более того, все альтернативные красители или не может быть или не работают хорошо, когда добавляются непосредственно в гель, поэтому гель должны быть сообщение окрашенных после электрофореза. Поскольку стоимость, простота использования, и чувствительность, EtBr остается краска для многих исследователей. Тем не менее, в определенных ситуациях, например, при утилизации опасных отходов затруднено или когда молодые студенты выполняют эксперимент, менее токсичных красителей может быть предпочтительным.

Загрузка красителей, используемых в гель-электрофореза преследуют три основные цели. Сначала они добавляют плотность образца, Что позволяет ему погружаться в гель. Во-вторых, красителей обеспечивает цвет и упрощения процесса загрузки. Наконец, красители двигаться по стандартным ставкам, через гель, что позволяет для оценки расстояния, что фрагменты ДНК были перенесены.

Точные размеры отдельных фрагментов ДНК может быть определена путем построения журнала молекулярного веса для различных групп ДНК стандарт, по расстоянию от каждой полосы. ДНК стандарт содержит смесь фрагментов ДНК заранее определенного размера, который можно сравнить с неизвестных образцов ДНК. Важно отметить, что различные формы ДНК перемещаться по гель с различными скоростями. Суперспиральная плазмидной ДНК, благодаря своей компактной конформации, проходит через гель быстрее, а затем линейный фрагмент ДНК одного и того же размера, с открытой круглой формы путешествий медленный.

В заключение, после принятия агарозном геле в 1970-х годов для разделения ДНК, она имеетоказался одним из самых полезных и универсальных методов в биологические исследования науки.