Un système de neurones primaires de la culture pour l'étude de l'herpès simplex virus de latence et de réactivation
Özet
Le protocole décrit un système de modèle efficace et reproductible pour étudier l'herpès simplex virus type 1 (HSV-1) temps de latence et la réactivation. Le dosage utilise des cultures de neurones sympathiques homogènes et permet pour la dissection moléculaire des virus de neurones interactions en utilisant une variété d'outils, y compris l'interférence ARN et d'expression de protéines recombinantes.
Abstract
Herpes simplex virus de type 1 (HSV-1) établit une infection latente long de la vie dans les neurones périphériques. Ce réservoir latent est la source d'événements récurrents qui réactivation d'assurer la transmission et de contribuer à la maladie clinique. Antiviraux actuels n'ont aucune incidence sur le réservoir latent et il n'existe aucun vaccin. Bien que les détails moléculaires de la réplication lytique sont bien caractérisés, les mécanismes de contrôle de latence dans les neurones restent insaisissables. Notre compréhension actuelle de la latence est dérivé d'études videodan vivo utilisant des modèles de petits animaux, qui ont été indispensables pour définir les exigences de gènes viraux et le rôle des réponses immunitaires. Cependant, il est impossible de distinguer les effets spécifiques sur la relation virus-neurone à partir des conséquences plus générales de l'infection médiée par les cellules immunitaires de soutien ou de non-neuronale dans les animaux vivants. En outre, l'expérimentation animale est coûteux, chronophage, et limitée en termes d'options disponibles pour la manipulation de l'hôteprocessus. Pour surmonter ces limitations, un système de neurones seule est désespérément nécessaire qui reproduit les caractéristiques de l'in vivo de la latence et la réactivation, mais offre les avantages de la culture de tissus en termes d'homogénéité et de l'accessibilité.
Nous présentons ici les plus un modèle in vitro utilisant cultivées primaires neurones sympathiques de rat ganglions cervicaux supérieurs (SCG) (Figure 1) pour étudier le HSV-1 de latence et la réactivation qui correspond si ce n'est pas tous les critères souhaités. Après avoir éliminé les cellules non neuronales, près homogènes TrkA + de cultures de neurones sont infectés par le HSV-1 en présence d'acyclovir (ACV) pour supprimer la réplication lytique. Après l'enlèvement ACV, non-productives HSV-1 infections qui présentent fidèlement caractéristiques reconnues de latence sont efficacement mis en place. Notamment, les ARNm lytiques, les protéines et de virus infectieux devenir indétectable, même en l'absence de sélection, mais la latence associée à la transcription (LAT) exprimentions persiste dans les noyaux des neurones. Les génomes viraux sont maintenus à un nombre de copies en moyenne de 25 par neurone et peut être amené à répliquer de manière productive en interférant avec la PI3-kinase / AKT signalisation ou le retrait pur et simple du facteur de croissance nerveuse 1. Un EGFP recombinante HSV-1 fusionnée à la codage virale protéine lytique Us11 fournit une fonction, en temps réel marqueur pour la réplication résultant de réactivation qui est facilement quantifié. En plus de traitements chimiques, les méthodes génétiques telles que la livraison interférence ARN ou d'un gène par des vecteurs lentiviraux peut être appliquée avec succès au système permettant d'études mécanistes qui sont très difficiles, voire impossible, chez les animaux. En résumé, la CTB à base de HSV-1 de latence / réactivation du système fournit un outil puissant, nécessaire pour élucider les mécanismes moléculaires contrôlant la latence et la réactivation de HSV1 dans les neurones, un puzzle de longue date en virologie dont la solution peut offrir des perspectives nouvelles dans le développement de nouvelles thérapies qui t cibleil latente réservoir herpèsvirus.
Protocol
Discussion
Cette culture de neurones primaires et du système d'infection fournit une méthode simple et efficace pour explorer les mécanismes moléculaires qui sous-tendent le HSV-1 de latence et la réactivation. Le système fidèlement récapitule les poinçons acceptées de latence définies dans les deux infections humaines et d'animaux vivants des modèles. Lorsque le virus est latent dans les cultures CTB, des particules virales infectieuses et des produits géniques lytiques ne peut pas être dét…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier les réviseurs pour leurs suggestions qui ont contribué à améliorer ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par des subventions à MVC (NS21072, HD23315), ACW (GM61139, S10RR017970) et IM (AI073898, GM056927) du NIH. MK a été soutenu en partie par une subvention du NIH de formation (5T32 AI007180).
Materials
| Reagent | Company | Catalog# | Yorumlar |
| 70μm nylon filter( cell strainer) | BD Biosciences | 352350 | |
| 1x Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS-/-) | Invitrogen | 14175 | w/o CaCl2 and MgCl2 |
| 1x Minimum Essential Media (MEM) | Invitrogen | 11095-080 | |
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Sigma | F0503 | prepare 20 mM stock in 1x MEM; store at -20°C |
| 96-well flat well bottom TC plates | Corning | 3599 | |
| Acyclovir | Calbiochem | 114798 | prepare 31 mM stock in DMSO; store at -20°C |
| Aphidicolin | Calbiochem | 178273 | prepare 10 mM stock in DMSO; store at -20°C |
| B-27 Supplement | Invitrogen | 17504-44 | |
| Collagenase | Sigma | C2674 | prepare 10 mg/ml stock in HBSS-/-; store at -20°C |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G6152 | prepare 40% stock in H2O; filter sterilize & store at 4°C |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | prepare 1 mg/ml stock in H2O; quick-freeze 20 μl aliquats & store at -80°C; dilute to 2 μg/ml working conc. in sterile H2O |
| Leibovit’z L-15 media | Invitrogen | 11415 | |
| Nerve Growth Factor | Harlan Laboratories | BT.5017 | prepare 50 μg/ml stock in HBSS-/-; store at -80°C |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 12348 | |
| Phosphonoacetic acid (PAA) | Sigma | P6909 | prepare 75 mg/ml stock in H2O; store at -20°C |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P0899 | prepare 20 mg/ml stock in H2O; store at -20°C |
| Rat-tail collagen | Millipore | 08-115 | Concentration varies with supply lot; store at 4°C and dilute to 0.66 mg/ml working conc. in sterile H2O |
| Trichostatin A | Sigma | T8552 | prepare 1 mM stock in DMSO; store at -20°C |
| Trypsin 2.5% | Invitrogen | 15090-04 |
Referanslar
- Camarena, V., Kobayashi, M., Kim, J. Y., Roehm, P., Perez, R., Gardner, J., Wilson, A. C., Mohr, I., Chao, M. V. Nature and duration of growth factor signaling through receptor tyrosine kinases regulates HSV-1 latency in neurons. Cell Host & Microbe. 8, 320-330 (2010).
- Johnson, M. I., Fedoroff, S., Richardson, A. Primary cultures of sympathetic ganglia. Protocols for Neural Cell Culture. , 71-94 (2001).
- Letourneau, P. C., Fedoroff, S., Richardson, A. Preparation of substrata for in vitro culture of neurons. Protocols for Neural Cell Culture. , 245-254 (2001).
- Price, J. P., Brewer, G. J., Fedoroff, S., Richardson, A. Serum-free media for neural cell cultures. Protocols for Neural Cell Culture. , 255-264 (2001).
- Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. . Principles of virology. , (2008).
- Roizman, B., Pellett, P. E., Knipe, D. M., Howley, P. M. The family Herpesviridae: A brief introduction. Fields Virology. 2, 2381-2397 (2001).
- Price, R. W., Rubenstein, R., Khan, A. Herpes simplex virus infection of isolated autonomic neurons in culture: viral replication and spread in a neuronal network. Arch. Virol. 71, 127-140 (1982).
- Tomishima, M. J., Enquist, L. W. A conserved alpha-herpesvirus protein necessary for axonal localization of viral membrane proteins. J. Cell Biol. 154, 741-752 (2001).
- Ch’ng, T. H., Flood, E. A., Enquist, L. W. Culturing primary and transformed neuronal cells for studying pseudorabies virus infection. Methods Mol. Biol. 292, 299-316 (2005).
- Wang, F., Tang, W., McGraw, H. M., Bennett, J., Enquist, L. W., Friedman, H. M. Herpes simplex virus type 1 glycoprotein E is required for axonal localization of capsid, tegument, and membrane glycoproteins. J. Virol. 79, 13362-13372 (2005).
- Benboudjema, L., Mulvey, M., Gao, Y., Pimplikar, S. W., Mohr, I. Association of the herpes simplex virus type 1 us11 gene product with the cellular kinesin light-chain-related protein PAT1 results in the redistribution of both polypeptides. J. Virol. 77, 9192-9203 (2003).
- Blaho, J., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. Herpes simplex virus: propagation, quantification and storage. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 14, Unit 14E.1 (2005).
- Van Zeijl, M., Fairhurst, J., Jones, T. R., Vernon, S. K., Morin, J., LaRocque, J., Feld, B. L., O’Hara, B. L., Bloom, J. D., Johann, S. V. Novel class of thiourea compounds that inhibit herpes simplex virus type 1 DNA cleavage and encapsidation: resistance maps to the UL6 gene. J. Virol. 74, 9054-9061 (2000).
- Newcomb, W. W., Brown, J. C. Inhibition of herpes simplex virus replication by WAY-150138: assembly of capsids depleted of the portal and terminase proteins involved in DNA encapsidation. J. Virol. 76, 10084-10088 (2002).
- Pesola, J. M., Zhu, J., Knipe, D. M., Coen, D. M. Herpes simplex virus 1 immediate-early and early gene expression during reactivation from latency under conditions that prevent infectious virus production. J. Virol. 79, 4516-14525 (2005).
- Arthur, J. L., Scarpini, C. G., Connor, V., Lachmann, R. H., Tolkovsky, A. M., Efstathiou, S. Herpes simplex virus type 1 promoter activity during latency establishment, maintenance and reactivation in primary dorsal root neurons in vitro. J. Virol. 75, 3885-3895 (2001).
- Danaher, R. J., Jacob, R. J., Steiner, M. R., Allen, W. R., Hill, J. M., Miller, C. S. Histone deacetylase inhibitors induce reactivation of herpes simplex virus type 1 in a latency-associated transcript- independent manner in neuronal cells. J. Neurovirol. 11, 306-317 (2005).
- Terry-Allison, T., Smith, C. A., DeLuca, N. A. Relaxed repression of herpes simplex virus type 1 genomes in murine trigenminal neurons. J. Virol. 71, 12394-12405 (2007).
- Harris, R. A., Preston, C. M. Establishment of latency in vitro by the herpes virus type 1 mutant in1918. J. Gen. Virol. 72, 907-913 (1991).
- Wagner, E. K., Bloom, D. C. Experimental investigation of herpes simplex virus latency. Clin. Microbiol. Rev. 10, 419-443 (1997).
- Strelow, L. I., Laycock, K. A., Jun, P. Y., Rader, K. A., Brady, R. H., Miller, J. K., Pepose, J. S., Leib, D. A. A structural and functional comparison of the latency-associated transcript promoters of herpes simplex virus type 1 strains KOS and McKrae. J. Gen Virol. 75, 2475-2480 (1994).
- Stroop, W. G., Banks, M. C. Herpes simplex virus type 1 strain KOS-63 does not cause acute or recurrent ocular disease and does not reactivate ganglionic latency in vivo. Acta Neuropathol. 87, 14-22 (1994).
- Sawtell, N. M., Poon, D. K., Tansky, C. S., Thompson, R. L. The latent herpes simplex virus type 1 genome copy number in individual neurons is virus strain specific and correlates with reactivation. J. Virol. 72, 5343-5350 (1998).
- Thompson, R. L., Cook, M. L., Devi-Rao, G., Wagner, E. K., Stevens, J. G. Functional and molecular analysis of the avirulent wild-type herpes simplex virus type 1 strain KOS. J. Virol. 58, 203-211 (1986).
- Wilcox, C. L., Smith, R. L., Freed, C. R., Johnson, E. M. Nerve growth factor-dependence of herpes simplex virus latency in peripheral sympathetic and sensory neurons in vitro. J. Neurosci. 10, 1268-1275 (1990).
- Roehm, P. C., Camarena, V., Gardner, J. B., Wilson, A. C., Mohr, I., Chao, M. V. Cultured vestibular ganglion neurons demonstrate latent herpes simplex type I reactivation. Laryngoscope. 121, 2268-2275 (2011).
- Kuhn, M. A., Nayak, S., Camarena, V., Gardner, J., Wilson, A., Mohr, I., Chao, M. V., Roehm, P. C. A cell culture model of facial palsy resulting from reactivation of latent herpes simplex virus type 1. Otology & Neurotology. , (2012).
