Özet

Singola cella Analisi Bacillus subtilis I biofilm usando la microscopia a fluorescenza e citometria a flusso

Published: February 15, 2012
doi:

Özet

Biofilm microbici sono generalmente costituiti da distinti sottopopolazioni di cellule specializzate. Cella singola analisi di queste sottopopolazioni richiede l'uso di reporter fluorescenti. Qui descriviamo un protocollo di visualizzare e monitorare diversi subpopulationswithin<em> B. subtilis</em> Biofilm mediante microscopia a fluorescenza e citometria a flusso.

Abstract

Formazione di biofilm è un attributo per quasi tutti i batteri 1-6. Quando batteri formano biofilm, le cellule sono racchiusi nella matrice extracellulare che è prevalentemente costituito da proteine ​​e esopolisaccaridi, tra gli altri fattori 7-10. La comunità microbica racchiuso all'interno del biofilm spesso mostra la differenziazione della distinta sottopopolazione di cellule specializzate 11-17. Queste sottopopolazioni coesistono e spesso mostrano organizzazione spaziale e temporale all'interno del biofilm 18-21.

Formazione di biofilm nel modello Bacillus subtilis richiede la differenziazione delle sottopopolazioni di cellule specializzate distinte. Tra questi, la sottopopolazione di produttori matrice, responsabili di produrre e secernere la matrice extracellulare del biofilm è essenziale per la formazione di biofilm 11,19. Pertanto, la differenziazione dei produttori matrice è una caratteristica della formazione di biofilm in B. subtilis.

Abbiamo usato giornalisti fluorescenti per visualizzare e quantificare la sottopopolazione di produttori matrice in biofilm di B. subtilis 15,19,22-24. Concretamente, abbiamo osservato che la sottopopolazione di produttori matrice differenzia in risposta alla presenza di autoprodotto segnale extracellulare surfattina 25. È interessante notare, surfattina è prodotto da una sottopopolazione di cellule specializzate diverse dalla sottopopolazione di produttori matrice 15.

Abbiamo riportato in questa relazione l'approccio tecnico necessario per visualizzare e quantificare la sottopopolazione dei produttori e dei produttori matrice surfattina nei biofilm di B. subtilis. Per fare questo, reporter fluorescenti di geni necessari per la produzione di matrice e di produzione di surfattina sono inseriti nel cromosoma di B. subtilis. Reporter sono espressi solo in una sottopopolazione di cellule specializzate. Quindi, le sottopopolazioni possono esseremonitorata utilizzando la microscopia a fluorescenza e citometria a flusso (Fig. 1).

Il fatto che diverse sottopopolazioni di cellule specializzate coesistono all'interno delle comunità multicellulari di batteri ci dà una prospettiva diversa sulla regolazione dell'espressione genica nei procarioti. Questo protocollo affronta questo fenomeno sperimentalmente e può essere facilmente adattato a qualsiasi modello di altre lavorazioni, per chiarire i meccanismi molecolari alla base eterogeneità fenotipica all'interno di una comunità microbica.

Protocol

1. Etichettatura B. subtilis e formazione di analisi Biofilm Amplificazione PCR dalla regione del promotore del gene di interesse. Si mostra come esempio la clonazione di P tapa, il promotore dei geni responsabili per la produzione di proteina Tasa matrice 26. Clone P tapa in pkm008 vettore (creato dal laboratorio di Rudner, Harvard Medical School. Boston, USA) (Fig. 2). Linearizzare i plasmidi per digestione enzimatica (Enzyme consigliato,…

Discussion

Il fatto che le comunità batteriche mostrano sottopopolazioni di cellule che esprimono set specifico di geni evidenzia la complessità delle comunità microbiche 33,34. Questo protocollo dovrebbe aiutare a determinare se l'espressione di un gene di interesse viene limitata a un particolare sottopopolazione di cellule specializzate nella comunità microbica. Visualizzazione di tali sottopopolazioni richiede lo sviluppo di nuove tecniche, perché i metodi tradizionali per monitorare l'espressione genic…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è finanziato dal programma Young Investigator Research, dal Centro di ricerca sulle malattie infettive (ZINF) presso l'Università di Würzburg. Juan Garcia-C Betancur è un collega dottorato di ricerca presso la Graduate School of Life Sciences (GSLS) dell'Università di Würzburg.

Materials

Technique Name of the reagent Company Catalog number
MSgg composition potassium phosphate 5mM Roth 6878
MOPS 100mM Sigma-Aldrich M1254
Magnesium chloride 2mM Roth 2189.1
Calcium chloride 700μM Roth A119.1
Ferric chloride 50μM Sigma-Aldrich 157740
Zinc chloride 1μM Applichem A2076
Thiamine 2μM Sigma-Aldrich 74625
Glycerol 0.5% Roth 7533
Glutamate 0.5% Sigma-Aldrich 49621
Tryptophan 50μg/ml Sigma-Aldrich T0254
Phenylalanine 50μg/ml Sigma-Aldrich P2126
Cell fixation Paraformaldehyde Roth 0335
Name of the equipment Company Catalog number
Sonication Cell Sonicator Bandelin D-1000
Fluorescence Microscopy Fluorescence Microscope Leica DMI6000B
Name of the software Company Catalog Number
Fluorescence Microscopy AsaF Leica
Flow cytometry FCASDiva BD
Flow cytometry FlowJo Treestar

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Bu Makaleden Alıntı Yapın
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