Filmes de seda são uma nova classe de biomateriais facilmente personalizáveis para uma vasta gama de aplicações biomédicas. O sistema de cultura de seda apresentado filme é altamente adaptável a uma variedade de<em> In vitro</em> Análises. Este sistema representa uma oferta de plataforma biomaterial projeto<em> In vitro</em> Otimização antes de tradução direta para<em> In vivo</em> Modelos.
Películas de seda são promissores proteína à base de biomateriais que podem ser fabricadas com alta fidelidade e economicamente dentro de um ambiente de investigação 1,2 laboratório. Estes materiais são desejáveis porque possuem altamente controlável características dimensionais e material, são biocompatíveis e promover a adesão celular, pode ser modificado através de padronização topográfica ou pela alteração química de superfície, e pode ser usado como um depósito para as moléculas biologicamente activas para aplicações de entrega de drogas relacionados 3-8. Além disso, as películas de seda são relativamente simples de design personalizado, pode ser concebido para dissolver dentro de minutos ou degradar ao longo do ano, in vitro ou videodan vivo, e são produzir com o benefício adicional de ser transparente na natureza e, portanto, altamente adequado para aplicações de imagiologia 9 – 13. A metodologia de sistema de cultura aqui apresentada representa uma abordagem escalável para avaliações rápidas de células-seda superfície do filmeinterações. De particular interesse é a utilização de películas de superfície de seda estampados para estudar as diferenças na proliferação celular e respostas das células para o alinhamento 12,14. As culturas semeadas foram cultivadas em dois micro-padronizado e substratos filme plano de seda, e, em seguida, avaliados através de lapso de tempo de imagens de contraste de fase, microscopia eletrônica de varredura e avaliação bioquímica da atividade metabólica e teor de ácido nucléico. Em resumo, o filme de seda sistema in vitro de cultura oferece uma configuração customizável experimental adequado para o estudo da superfície celular interacções sobre um substrato biomaterial, que podem então ser optimizadas e, em seguida, traduzido a modelos videodan vivo. Observações utilizando o sistema de cultura aqui apresentados estão actualmente a ser utilizada para auxiliar em aplicações que variam de interacções de células básicas para concepção de dispositivos médicos, e, portanto, são relevantes para uma ampla gama de campos biomédicas.
A utilização de películas de seda regeneradas como um substrato para a cultura de células ganhou em popularidade ao longo das duas últimas décadas, devido à extensa caracterização das propriedades do material desta proteína e aumento da compreensão da sua utilidade biomaterial 3,8. O sistema de cultura descrito aqui representa um novo sistema de testes in vitro para avaliar as interações de superfície celular em seda estampados filme biomaterial substratos 7. O sistema permite a análise em profundidade das interações celulares ao longo do tempo que podem ser facilmente adotados para alto rendimento de coleta de dados. Isto é largamente activado porque os filmes de seda possuir um número de propriedades sintonizáveis biomaterial que pode ser modificada para afectar directamente a função da célula 8,9,12, incluindo: controlo de superfície micro / nano-topografia de superfície 7; químicas de superfície diferentes através da modificação covalente ou adsorção de moléculas biologicamente ativas 13; mech robustapropriedades anical 15,16, controle da hidrofilicidade material / hidrofobicidade 16; carregamento em massa de compostos biológicos para a liberação 4,8,17, e de dissolução controlada / taxas de degradação enzimática através do controle da estrutura secundária (conteúdo folha beta) 11,18,19 .
A transparência de filmes de seda é conseguido através de recozimento dos filmes por um período de tempo sob vácuo na presença de vapor de água 7,15. Esta abordagem permite o processamento para a formação de folhas β estrutura secundária, promovendo a insolubilidade do material em água, permitindo simultaneamente difracção mínima de luz 15. Essa transparência de filmes é fundamental para permitir que imagens ao vivo direto de célula que pode ser contratado com um número de modalidades de imagem (ou seja, de campo amplo e fluorescência) usando qualquer número de sistemas de microscópio 12,20. Além vivo de células de imagem, os filmes de seda pode ser facilmente removido do thsistema de cultura e para permitir a fixação adicional e análise. Assim, a grande variedade de directos avaliações experimentais que podem ser realizados neste sistema são aplicáveis a uma grande variedade de células / tecido fontes para muitos campos técnicos 3,8,9,12,13,21. Os resultados lapso de tempo de imagens ilustram como os dados em tempo real de cultura podem ser recolhidos, e como exemplo, foram utilizadas para ilustrar como topografia da superfície afeta as interações celulares. Os resultados representativos demonstram como biomateriais filme de seda podem ser utilizadas para suportar o crescimento da cultura HCLE, e são alteráveis a um número de proliferação celular padrão e ensaios de metabólicas (Fig. 4). Além disso, as culturas são fixadas e processadas para digitalização de imagens de electrões ou outros protocolos (Fig. 3).
Substratos filme de seda são produzidas no laboratório com alta fidelidade, a consistência, e com um custo relativamente baixo (Fig. 1). Isto permite reprodutibilidadedade, tanto na configuração do sistema de cultura e os resultados experimentais. Tem sido demonstrado que a água-anneal processamento produz um material de película estável dentro da cultura de seda que tem definido taxas de degradação enquanto se aguarda a concentração de proteases em solução 2,15,22. Como resultado, estes materiais podem ser usados durante períodos de tempo prolongados para a longo prazo de cultura de células, ou permanecer implantado por meses ou anos, dependendo da localização fisiológica 8. Além disso, trabalhos recentes demonstraram que tanto a estrutura da proteína e as propriedades do material de filmes água-recozido de seda são consistentes de lote para lote permitindo resultados da cultura reprodutíveis como mostrado através de vários métodos de ensaio mecânicas e biofísica 15,16. Além disso, a superfície do material mostrou grande fidelidade entre lotes de película, tal como indicado por SEM, de força atómica micrscopy (AFM), e os estudos de cultura de células {Lawrence: 2008wr, Omenetto: 2008tc, Bray: 7,23,24} 2011kq. Stabil materialdade e consistência é um fator importante a forma como a célula irá sentir o substrato de cultivo através das vias mecanotransdução vários, e, finalmente, produzir uma resposta desejada / não desejada celular 25,26.
Normas históricos para substratos de cultura, tais como o plástico de cultura de tecidos tratados ou de vidro, proporcionar substratos adequados para ligação celular. No entanto, estes materiais não são alteráveis para a utilidade adicional in vivo. Pode ser previsto que um filme de seda biomaterial pode ser personalizado in vitro, e uma vez expectativas experimentais foram realizados a película personalizado pode ser directamente convertido para um modelo videodan vivo. Desenho emparelhado tais entre in vitro e videodan vivo experimentação oferece uma grande vantagem para tais biomateriais de seda implantáveis mais de outros substratos que são rotineiramente usados in vitro.
The authors have nothing to disclose.
O financiamento do NIH K08EY015829, R21EY019561, R24EY015656, P41 EB002520 e R01 Pesquisa EY020856 para prevenir a cegueira Prêmio de Desenvolvimento de Carreira, e Tri-Institucional Iniciativa Stem Cell. Linha celular HCLE uma cortesia da Dr. Ilene Gipson. Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Liu Aihong do Weill Cornell Medical College por sua assistência e orientação técnica com cultura de células, Anthony Labissiere no Hospital de Cirurgias Especiais para a assistência técnica com imagens SEM, a Engenharia de Tecidos Resource Center (TERC) em Tufts University para suporte técnico com o desenvolvimento material, e do Centro Cornell de Nanociência e Tecnologia Facility (CNF) para a assistência na fabricação de wafer de silício.
Material Name | Company | Catalogue Number |
Silk cocoons | Tajima Shoji Co., LTD. | NA |
PDMS monomer and cross-linker | Momentive | RTV615A 01P |
Sodium Carbonate | Sigma | S2127 |
Lithium Bromide | Sigma | 213225 |
Slide-A-Lyzer | Thermo Scientific | 66110 |
1 mL Syringe | Becton-Dickenson | 309602 |
Stainless steel washer | Superior Washer | 81610 |
24-well plate | VWR | 353047 |