用絹フィルム培養システム in vitroで分析とマテリアルデザイン

1。シリコーンゴム金型の作製鋳造の目的の地形面を生成したり、購入してください。このパブリケーションの場合は標準の100ミリメートルエッチングされたシリコンウェハ（ 図1）について説明する。 ポリジメチルシロキサン（PDMS）（コンポーネント）と購入したキットで提供される1時09分の比率（9グラムポッティングと1グラムの触媒）の触媒（成分B）ソリューションをポッティングを量る。 硬化プロセスを開始するために徹底的に解決策を混ぜる。 鋳造皿内の場所のシリコンウェーハ表面。 シリコンウェハ上にPDMS液の4.5グラムを秤量する。 ウェーハ表面の直径100mmの領域を覆うようにPDMSソリューションを広げる。 均等にPDMSソリューションを広めるためにウェハを傾けてください。 直径100mmのペトリ皿の蓋でウェハをカバーしています。 場所は、硬化が平らな面に行われていることを特定すること、一晩60℃のオーブンにセットアップを鋳造。 場所70％エタノールにPDMS /シリコンウエハー硬化削除する前にお風呂。 最初のエッジ（全周）を持ち上げるためにカミソリの刃を使用してウエハからPDMSの削除を開始。 静かにシリコーンゴム鋳造を引き裂くないように注意して70％エタノール槽内に鉗子を使用してオフにPDMSを引き出します。 14ミリメートル穴パンチを使用して、個々のPDMSモールドパンチアウト。この直径は、24ウェルプレートのセットアップに収まるように設計されています。 2。シルクソリューションの生産ガラスビーカー7内沸騰蒸留水（のdH 2 O）の2 Lを持参してください。 分にカイコ蚕の繭の5グラムをカットします。 過度の昆虫微粒子コーティング内側の繭の表面によって示されるように広範囲に汚染された繭を廃棄してください。 炭酸ナトリウムの4.24グラムを測定します。 水のふきこぼれを防止し、続行する前に完全な溶解を可能にするために沸騰のdH 2 Oボリュームに徐々に炭酸ナトリウムを追加します。 沸騰DHに繭の部分を追加します。 <su40分間b>]を2 O、及び沸騰過程で繭をかき混ぜるためにテフロン被覆攪拌棒を使用しています。 沸騰した後、慎重に余分な水分を除去するために手でシルクエキスよりシンクとリングにのdH 2 Oを排出する。 シルクは20分を3回抽出洗浄します。ラボのビーカーでのdH 2 Oの1 Lの各、ビーカー内のボリュームを循環させるために攪拌棒を使用しています。 12時間の乾燥を可能にするために、化学フード内側に手と場所絹繊維抽出物による絹のエキスを洗浄した後、リング。期間。 次の日、通常は〜3.5 gである乾燥した絹繊維を、重量：___________-G シルク20％w / v溶液は9.3 M臭化リチウム溶液を調製します。必要な重量とボリュームを計算するには、次の方程式を利用する： （ステップ10からシルクエキスの重量）×（4）=合計9.3 M臭化リチウム溶液の___________-mLの [（807.705）×（一部11.AからLiBrのボリューム）] / 1000 = LiBrの___________ gはのdH 2 Oに追加する </ LI> 以下のdH 2 O量のガラスビーカーに測定した臭化リチウムの重量を追加します。 （0.8）×（ステップ11.Aから計算されたボリューム）= ___________のdH 2 O mLのメスシリンダー、一部締めくくりで計算された最後のボリュームにソリューションをもたらす適切なサイズにこのソリューションを注ぐビーカーに絹のエキスを置き、シルク繊維はラボのスパチュラを用いて臭化リチウム溶液を内に浸漬されていることを確認すること絹繊維上の臭化リチウム溶液を注ぐ。 60に溶解した絹を置き°で4時間Cオーブン： 開始時刻：___________ 終了時間：___________ 適切なサイズのシリンジを使用すると、シルク液12 mLを策定する。注射器の先端に18G針を配置して、透析カセット（3,500 MWのcoutoff、スライド-Lyzer、サーモサイエンティフィック）に溶液を注入します。カセットを充填した後、空にシリンジでカセットのうち、残りの空気を描画します。 場所FIのdH 2 Oの1 L中にlled透析カセット 1時間、4時間、8時間後、6変化の合計3倍、12時間後のdH 2 O量を変更します。 開始：___________ 1時間：___________ 4時間：___________ 8時間：___________ 12時間：___________ 12時間：___________ 12時間：___________ 終了：___________ 透析後、ゆっくりとシリンジを用いてカセットから絹のソリューションを収集します。万グラム定格遠心チューブに配置するソリューションを提供します。 20分ごとに4℃で10,000 gで倍溶液を遠心分離します。新しいチューブに上清をそれぞれ遠心分離後の場所。 4℃の冷蔵庫で保管してTHRシルク·ソリューションを提供します。 ピペット2つの小さな計量皿に0.5mLのシルクソリューションのサンプル、および場所は、12時間または絹溶液の乾燥するまで60°C乾燥炉内部に皿の重量を量る。 ボットから残りの固体絹フィルムの重量を量るhは試料体積のタンパク質濃度に絹溶液の重量パーセントを測定する。 合計2の絹フィルムサンプルの重量：___________ミリグラム （23.aから重量）×（100）= ___________％シルク 3。シルクフィルムと文化システムのセットアップの準備ほこりを削除するには、clearテープでクリーニングしてPDMS鋳造表面を準備します。 きれいなPDMS基板70％エタノールに浸漬とのdH 2 Oで3回洗浄一般的に24ウェルプレートのふたで押さえ板、上に場所14ミリメートルPDMSモールドを。 50μmの厚膜を生成するために、一般的に1 mLのシリンジ先端2は液体拡散ツールを使用して、PDMSモールドに8％の絹溶液を70μlsを広げた。 シルクフィルムは90分の期間、150 Paの空気の流れの圧力を実行しているクリーンベンチやフィルム乾燥しているまで明らかに乾燥させます。 かつて映画はPDMS mを含むフィルムの乾燥した場所全体のセットです。歳は、水不溶性のフィルムを製造するために> 4時間水熱処理チャンバ内へ。これは通常、25 kPaの真空15で引っ張ら盆地の底に水と空のデシケーター室です。 クリーンベンチの上に水熱処理チャンバーと場所から絹フィルムを取り外します。 滅菌するために、少なくとも10分間、ウェル内に35ミリメートルのペトリ皿の中で70パーセントエタノール浴を準備し、代わりに制御基板（すなわち、ガラスまたはプラスチックの表面）とステンレス鋼リング。 鉗子を用いてPDMSを鋳型から絹フィルムを取り出し、70％エタノールにそれらを浸し、確かにパターニング側を70％エタノール1 mLであらかじめ入力さ24ウェルプレートに配置するサンプルは、細胞接着を可能にするために上を向いている。 上に対応するだけでなく場所のステンレス製リングの重み（11.65ミリメートル、内径、15.45ミリメートル、外径、1.18ミリメートルの厚さ）に、それぞれの絹フィルムのサンプルを配置した後。 リングが付いているサンプルは無菌性を確保するために10分間インキュベートすることができます。 レモEtOHをveとPBS 1 mLで3倍の各サンプルを洗浄します。各洗浄が完了した拡散を可能にするために5分間放置します。 シルクフィルムサンプルの下に気泡の大部分を削除することを確認しながら、吸引ガラスピペットを用いてPBSを削除します。 播種のセルラインを準備します。例として、7分間0.25％トリプシン及びエチレンジアミン四酢酸（EDTA）溶液とヒト角膜輪部上皮-（HCLE）細胞株をトリプシン処理。トリプシンは10％FBSを添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）通路メディアの1:1のボリュームを使用して無効にするを追加しました。トリプシン処理HCLE細胞を遠心し、細胞ペレットにケラチノサイト無血清培地（K-SFM）の8 mLを加え、穏やかにHCLEsを分散させるために撹拌し、細胞数を生成します。 よく一般的に10,000細胞/ cm 2の密度を使用して、当たりHCLE懸濁液サンプル500μL。 37℃インキュベーター内の場所の文化℃、5％CO 2および所望の実験プロトコルを実行します。 4。代表的な結果 <Pクラス= "jove_content"> 絹の映画制作と文化システムの準備の要約を示す図1のフローチャートは、10ステップのプロセス。 図2標準的なフォトリソグラフィーとドライエッチング技術を用いた90 ​​ミリメートルの直径のシリコンウエハ上に生成するパターン化されたラインの表面トポグラフィの（A）21染料配列。 （B）シルクフィルムは、PDMSモールドの表面に鋳造した後に元の平行線パターン化の機能を保持します。 （C）回路図デモ機能·サイズ·デザインは、細胞の配置を促進するために選ばれた。 （D）を保持並列並んでパターン化表面を示すシルクフィルムのクロスセクションを参照してください。 図3（）パターンに付着HCLE細胞株の走査電子顕微鏡写真と（B）培養中の2日目でフラットシルクフィルム。 HCLE文化は文化の日8（C）パターンと（D）平らな表面上でコンフルエントになるまで増殖し続けています。 図4（A、D、G）パターニング（B、E、H）フラットシルクフィルム文化HCLE細胞は比較的に（C、F、I）ガラスの制御基板（AC）1日目、（DF）4日目で、文化と（GI）日8。 （J）CyQuant核酸含有量および（K）（3 – パターンとフラットシルクフィルム基板の両方にHCLE可能性を示す（4,5 – ジメチルチアゾール-2 – イル）-2,5 – ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（MTT）の代謝活性の測定データ時間をかけてガラスのコントロールサーフェス（スケールバー= 100μm）に比較した場合。 ビデオ1で18時間の間にパターニングされた絹フィルム表面上に移行するHCLE細胞のタイムラプス位相コントラストイメージング。期間。細胞は10k/cm 2の密度で播種し、2時間培養した。イメージングの前に。 ムービーを表示するには、ここをクリック 。 ビデオ2で18時間の間に平らなTCP制御表面上に移行するHCLE細胞のタイムラプス位相コントラストイメージング。期間。細胞は10k/cm 2の密度で播種し、2時間培養した。イメージングの前に。 ムービーを表示するには、ここをクリック 。