丝绸电影文化系统在体外分析和生物材料设计

1。硅橡胶模具制作生产或购买所需的地形表面的铸造。有关本刊物将一个标准的100毫米的蚀刻硅片（ 图1）。 掂量出聚二甲基硅氧烷（PDMS）灌封（组分A）和催化剂（B组分）在1:9的比例（9克灌封和1 g催化剂），在购买套件提供的解决方案。 混合解决方案，全面启动固化过程。 场所内铸造菜的硅晶片表面。 掂量出到硅片上的PDMS解决方案4.5Ğ。 蔓延的PDMS解决方案，涵盖了100毫米直径的晶圆表面面积。 倾斜的晶圆均匀散布的PDMS解决方案。 直径100毫米的培养皿盖盖上晶圆。 现浇设置到60℃以上烤箱晚上，使得某些固化在一个平面上。 地方治愈的PDMS /硅片到70％的乙醇洗澡前去除。 开始去除从晶圆硅橡胶用刀片，首先解除边缘（整个圆周）。 轻轻拉断钳小心不要撕硅橡胶浇铸在70％乙醇浴中使用的硅橡胶。 冲床出个人的PDMS模具使用14毫米打孔。这个直径的设计以适应24孔板设置。 2。生产的丝绸解决方案 7在一个玻璃烧杯，带2 L的蒸馏水（DH 2 O）的沸腾。 切成三分之二家蚕蚕茧5Ğ。 广泛污染茧过度昆虫颗粒涂层内的茧表面处理。 测量4.24Ğ碳酸钠。 慢慢加入碳酸钠煮DH 2 O量，以防止过 ​​水的沸点，并允许完全溶解，然后再继续。 添加茧件沸腾DH <suB> 2直径为40分钟，并用聚四氟乙烯涂层的搅拌棒搅拌沸腾过程中的蚕茧。 煮沸后，用手工精心排出DH 2 O的丝绸提取出来的成片和环，以去除多余的水。 洗丝绸提取20分钟三次。每1 2 DH L在实验室烧杯中，用搅拌棒烧杯容积内流通。 经过洗涤，丝绸提取出来的手环和地方蚕丝纤维提取的化学物质罩内，以便为12小时干燥。时期。 第二天，权衡干燥的蚕丝纤维，这是典型〜3.5Ğ：__________-G 准备了20％W / V解决丝绸溴化锂溶液9.3米。利用下列公式计算所需的重量和体积： （从第10步丝绸提取物重量）×（4）= __________总额9.3米溴化锂溶液的毫升 （807.705）（溴化锂从量的一部分11.A）] / 1000 = __________克至溴化锂添加到DH 2 </ LI> 添加到以下DH 2 O容量的玻璃烧杯测量溴化锂重量： （0.8）×（从步骤11.A计算量）= __________ DH毫升2 倒入一个大小合适的量筒这一解决方案，并带来了解决方案最终成交量为部分11.a.计算放入烧杯丝绸提取物和溴化锂溶液倒在丝纤维确保蚕丝纤维沉浸在溴化锂使用解决实验室锅铲。 溶解丝放入60°C间4小时的烤箱： 开始时间：___________ 结束时间：___________ 使用适当大小的注射器，制定12毫升丝绸解决方案。将一个18G的针头，注射器，然后注入透析卡式（3,500兆瓦的coutoff，滑一仪，Thermo Scientific的）解决方案。填补了录像带后，剩余的空气抽出纸盒空的注射器。 地方科幻在1 L DH 2 O lled透析卡带更改后1小时，4小时，8小时，然后每12小时共6变化的3倍DH 2 O容量： 开始：___________ 1小时：_______________ 4小时：_______________ 8小时：_______________ 12小时：_______________ 12小时：_______________ 12小时：_______________ 最终：_______________ 透析后，慢慢地收集从磁带用注射器丝绸的解决方案。到10,000 g的额定离心管到位的解决方案。 解决方案的两倍，在4°C离心20分钟每个在10,000 g。经过每个的离心地方上清到一个新的管。 商店THR丝在4℃冰箱中的解决方案。 2吸取0.5毫升到小重量菜，地方丝绸解决方案的样品称量菜内60℃干燥12小时，或直至丝解决方案干燥炉。 从BOT的权衡剩下的固体丝膜Ĥ样本量蛋白浓度来衡量丝绸溶液％重量： 合并2丝膜样品：______毫克的重量 （从23.a重量）×（100）= ______％真丝 3。丝素膜的制备和文化系统设置准备的PDMS铸造表面用透明胶带清洗，以去除灰尘。 清洁的PDMS基板浸泡在70％乙醇洗三次DH 2 O 放置到14毫米的PDMS模具架板，这通常是一个24孔板盖。 以生产50微米厚的薄膜，传播上的PDMS模具用液体的传播工具，通常是1 mL注射器针尖2 70 8％的丝绸溶液μls。 允许干上一个干净的运行期为90分钟，直到电影霸150的空气流动压力的长凳上发现的丝膜干燥。 一旦电影干燥的地方，整个集电影，包括硅橡胶米孩子，到了4小时产生不溶于水的薄膜，退火水室。这通常是在盆地底部的水空干燥器在25 15 kPa的真空室拉。 除去丝膜退火水室和地方到一个干净的长椅。 准备在35毫米培养皿内70％的乙醇浴，和地方的控制基板（如玻璃或塑料表面）和不锈钢戒指，为至少10分钟，消毒水井。 丝膜的PDMS模具使用镊子取出，浸入70％乙醇，1毫升70％乙醇确保图案的一面预先填写的24孔板的样品放入朝上，使细胞粘附。 在每个丝膜样品放入顶部以及相应的地方不锈钢圈重量（内直径11.65毫米，外直径15.45毫米，1.18毫米厚度）。 允许带环的样品孵育10分钟，以确保无菌。 圣雷莫VE的乙醇和1毫升的PBS冲洗每个样品3倍。让每个洗坐5分钟，以便完整扩散。 除去PBS用玻璃吸管吸气，同时确保消除气泡丝膜样品下方的多数。 准备播种的细胞株。作为一个例子，trypsinize人角膜缘上皮细胞（HCLE）线，用0.25％胰蛋白酶和乙二胺四乙酸（EDTA）的解决方案，为7分钟。停用胰蛋白酶使用含10％胎牛血清1:1杜尔贝科的改良Eagle培养基（DMEM培养基）通过媒体的体积增加。离心胰酶消化HCLE细胞，角质细胞无血清媒体8毫升（的K-SFM）添加到细胞沉淀轻轻搅拌分散HCLEs的，并产生细胞计数。 样品500μL以及通常使用10,000个细胞/厘米2的密度每HCLE暂停。 孵化器内的地方文化，在37°C和5％CO 2和运行所需的实验协议。 4。代表结果 <一类p =的“jove_content”> 图1。流程图说明总结10步丝膜的生产工艺和文化系统的准备。 （一）21染料的阵列图案根据90毫米直径的硅用人标准光刻和干法刻蚀技术的晶圆生产线表面地形图2。 （二）丝绸电影后保留原来的平行线图案的特点，铸造硅橡胶成型表面。 （三）示意图展示功能尺寸设计选择促进蜂窝对齐。 （四）说明保留平行内衬表面图案的丝绸电影的横截面。 图3。扫描电子显微镜（一）图案秉承的HCLE细胞株（二）在文化2天在的扁丝电影。 HCLE文化继续扩散（三）图案及（D）平面合流文化8天。 图4（A，D和G）的图案和（B，E高）扁丝电影文化HCLE细胞相对（C，F）控制基板玻璃（交流）第1天，（DF）的第4天， （GI），在培养的第8天。 （十）CyQuant核酸含量和（k）（3 – （4,5 – 二甲基-2 – 基）-2,5 – 二苯基盐（MTT）代谢活性测定的数据表明图案和平面丝膜基板上HCLE可行性时相比，随着时间的推移玻璃控制面（比例尺= 100微米）。 视频1。时间流逝相衬成像HCLE细胞在18小时通过图案的丝膜表面迁移。一段时间。在2 10k/cm密度和细胞接种培养2小时。前成像。 点击这里观看电影 。 视频2。时间流逝相衬成像HCLE细胞在18小时平坦的TCP控制表面迁移。一段时间。细胞接种在2 10k/cm密度和培养2小时。前成像。 点击这里观看电影 。