聚合物芯片高通量发现的生物材料

1。的低结垢背景的制备放入到50mL离心管中称出2克的聚（甲基丙烯酸羟乙酯）（PHEMA）（Sigma公司 – 细胞培养测试）。溶解在50毫升95％（体积/体积）乙醇在水中。这通常需要24小时的超声。 浸涂环氧官能载玻片（Genetix）与PHEMA溶液。环氧基团会迅速形成共价键的PHEMA涂层。浸涂用镊子保持载玻片和浸渍到溶液中的滑动来实现。通常为5毫米的幻灯片留下未涂布，这是很有用的取向的幻灯片，并也可以作为作为粘接面的阳性对照。然后将幻灯片从PHEMA溶液排出超过1秒的期间，反相并放置干燥10分钟，然后放置在滑动架中的水平位置。 PHEMA包被的载玻片，然后留在大气条件下，1周，以允许完全蒸发吨他的溶剂。 2。单体溶液的制备称取120毫克的光聚合引发剂2,2 – 二甲氧基-2 – 苯基苯乙酮，并加至3毫升二甲基甲酰胺（DMF）中，使4％（重量/体积）的光引发剂的溶液。每个打印运行之前，这最好是新鲜的，所以制成的溶液的质量和体积可以变化，以适应需要多少光引发剂溶液。该溶液是稳定的长达一个月。 单体溶液是由通过加入1光引发剂溶液的一部分，3份整齐单体。这是通过移液到384以及源板5μL的光聚合引发剂的单体溶液和15μL。总体积为20μL点形成的理想选择。产量增加需要额外，印迹均匀点之前可以生产。更小的体积，可能会导致不完整的引脚加载。 此方法是目前使用的丙烯酸酯/甲基丙烯酸酯单体是可溶的在DMF中所vi限于rtue这些已经探索的组合，仅丙烯酰胺和其它溶剂有可能是适合于印刷过程中。为了实现建议的单体浓度（75％w / w的）液态单体也是必需的，尽管较低的单体浓度可以用于固体单体（单体浓度降低不出现不利改变所得聚合物的表面化学性质的但它是的分子量和玻璃化转变温度可能被改变）。高挥发性单体也很难使用之前由于快速蒸发的单体聚合时，UV固化步骤。将已蒸发根据一个运行可能需要长达6小时，并朝向端运行的挥发性单体的单体溶液的数量从源板。可以通过以下来实现印刷阶段冷却，和使用短打印仅运行使用的挥发性单体。 除了少数高亲水性单体如聚（乙二醇）丙烯酸酯，溶解在水相缓冲液的所得聚合物点没有被观察到，因此，不需要的交联单体的使用，虽然还没有被排除。 3。聚合物芯片的形成在图1中示意性地描绘了用于聚合物微阵列形成的，典型的过程。 微阵列的形成是使用接触机器人（Biodot），使用XYZ载物台（图2）实现的。使用直径为220μm的开槽上的大头针（Arrayit 96B）。在二氯甲烷中通过超声处理10分钟之前印数的，同样也应该被清洗的销保持器的所有引脚应清洗。 引脚被装入保持器，的印迹和阵列幻灯片加载，然后用氩气填充整个腔室，以降低含氧量水平低于2000ppm，这是足够的低，以避免由氧猝灭聚合自由基。湿度就是互斗d在30％至40％之间。包括湿度允许PHEMA膨胀允许所形成的聚合物的相互渗透的PHEMA层和成为物理截留到的表面2。 印数开始。每次运行包括： 将样品装入源板。引脚被降低到的解决方案，在速度为25毫米/秒，2.5秒，在溶液中举行，然后在25 mm / s的（图2）的速度排出。 在打印前删除单体溶液从外部引脚引脚必须被抹杀。随后单体交货的quilled部分的引脚，以实现一致的斑形成。干净的载玻片上使用的杂交序列包含33个触点。前四的位置联络的数是10，5，分别为4和3。接下来的四个位置2个触点，并在过去的3个位置接触。为每个联系人的总接触时间为10毫秒，方法和撤离速度为175毫米/秒。由这点，形成的斑点，应该有一个一致的形状和几何结构。在这一点上的故障指示不洁的标签或灰尘的单体溶液中的污染物。 的单体溶液，然后印到PHEMA涂敷的载玻片（图2）。一个接触在锁销的移动为175 mm / s的每个点和接触时间为10毫秒，这取决于单体溶液的粘度和表面能量，给出了一个平均的光点直径为400μm。通常为3复制阵列印刷到每个载玻片，共10张幻灯片上印有一个单一的运行。这相当于每个周期的30点。 脚在DMF洗涤。新鲜的DMF中的2.5 L的设置用于整个洗涤运行。销流浴搅拌洗涤。 与洗涤的同时，照射的刚印过的幻灯片用短波UV（365 nm）的源，在洗涤期间，持续30秒的持续时间为30毫伏/厘米2的密度。 一归根结底单体溶液印刷阵列用UV照射（365nm）的额外的10分钟。 刚印过的阵列被保持在低压力（<50毫乇）1周，以除去未聚合的单体和溶剂。 4。高通量的表面特性（HTSC） 在图3中示出的高温超导技术的一般方案。中部的自动化的，高吞吐量的方法是与表征装置的聚合物微阵列的取向。在所有的情况下，这是通过使用一个摄像头，给阵列的顶视图。最初，该阵列是与XY移动的阶段旋转对齐。然后位于阵列的拐角点和指定的特定坐标。各聚合物点的位置，然后，可以使用阵列的尺寸预测。 水接触角测量（WCA） WCA使用上躺滴法测量时自动KRUSS DSA 100仪器。 〜400皮升（pL）的体积的单个水滴被分配到各聚合物点的使用压电驱动的打印头。的聚合物点的直径一般是300微米，它的基的聚合物点上的水滴的直径通常为100微米，因此，只有一个测量可以得到每个聚合物现货。 XY载物台允许下的打印头7的各聚合物点的自动定位。这是通过使用位于阵列的顶视图，上面的示例，提供的相机。最初，摄像机的位置必须被调整对齐水液滴分配到相机视图的中心，则该数组可以向打印头对齐。 高速摄像机记录的液滴触及的表面，随后蒸发后的侧面轮廓。帧捕获的初始冲击的下拉是用来测量接触角。一个圆嵌合下拉利润Ie和接触角随后确定。 飞行时间二次离子质谱（TOF-SIMS） 样品加载到阶段。这涉及到首先衬用干净的铝箔，这有助于电荷补偿，然后通过使用金属螺丝标签，幻灯片。 样品载物台放置到输送室的TOF-SIMS和允许抽空至1.6×10 -6毫巴。然后将样品转移到的主要分析室，其通常具有1.0×10 -8毫巴的真空压力。 TOF-SIMS测量是使用ION-TOF IV使用单一同位素Bi 3 +的一次离子源工作在25 kV的“揉成模式”操作的仪器进行的。在分析区域，一个10秒的100×100微米面积的芯片，每个聚合物现货收集的正面和负面的二次离子脉冲1 pA的一次离子束扫描光栅第二次采集时间。离子群众的确定，采用了高分辨率飞行时间的分析仪可以准确的质量分配。典型的质量分辨率（M / Z 41）是6000多。低能量的电子（20 eV）的使用，以补偿所造成的在该绝缘表面8带正电的一次离子束的表面充电。 原子力显微镜（AFM） 一个大舞台的原子力显微镜的自动化阶段，需要分析载玻片上的阵列。一个的尺寸或ICON显微镜是用于此目的的理想选择。 样品被放置在舞台上和舞台位置驻留右上角的数组。 阵列的左下角的位置被发现，允许所有其它点的位置进行插值。 A位置列表被生成并送入自动采样功能的软件。 原子力显微镜的测量是使用奈米级3000A仪器在利用模E。约300千赫的谐振频率和力常数为40 N / m的硅尖与被使用（Tap300Al，预算传感器）。的5×5的微米区域的聚合物的量9。 均方根均方根（RMS）粗糙度测量在这一地区的每个图像使用SPIP批处理软件。每个图像最初是平坦化之前的粗糙度测量。 所有的图像都需要一个手动观看，以确定可能需要从粗糙度测量的成像文物。在此步骤中的图像也可以根据常用的表面特征9分类。 X-射线光电子能谱（XPS） 一个微阵列玻片使用双面胶带贴在样品棒，随后装入一个奎托斯轴超XPS仪器的样品室。 进入样品室，并等待，直到它到达一个压力低于10 -8乇。 相应的操作作为单色器单色化的X-射线源（铝，1486.​​6 eV）的参数，例如，阳极电势和电流（10kV及15毫安），光圈尺寸（110μm），通过能量（80 eV的宽扫描和20 eV的高分辨率扫描）是选择。重点是使用两个相对的角部的微阵列和优化从样品的氧信号的X-射线源。个别点的x和y位置，然后确定和记录的位置列表。 编写的程序图，然后运行数据的采集，包括广泛的扫描和高分辨率扫描特定元素的。 拉曼光谱拉曼光谱是使用拉曼显微镜的LabRam HR仪（Horiba Jobin Yvon公司）的各聚合物点。最初，拉曼信号被校准使用的硅晶片和在520.7厘米-1的拉曼位移的Si。 然后将样品放置在舞台上的焦点的激光（波长= 523 nm）的调整，以最大限度地提高CH拉曼位移在2950厘米-1。 然后，在微阵列上的左上点的中心的位置设定为原点，在地图上的微阵列是使用阵列功能的LabRam HR软件的安装。 累积10采集频谱对每个样品的照射时间为0.5 s。 5。细菌试验该阵列可以接触到许多不同的生物测定法，包括附着和增殖的骨髓间充质干细胞，其他细胞类型和细菌3,10,4。在这里，我们描述了一种细菌附着试验，这是示意性地示出在图4中。 一种细菌菌株转化的GFP表达质粒培养过夜，在37℃下在10毫升的LB培养基在50毫升falcon试管中以200rpm振荡。 的细菌培养物的OD 600测量和足够的过夜培养物接种到15毫升的RPMI-1640定义的介质，导致在最终OD 600为0.01。 数组是在无菌蒸馏水预洗10分钟以除去任何可溶解组件从阵列（未聚合的单体，低聚物和溶剂） 洗水阵列载玻片放置在一个干净的陪替氏培养皿和UV灭菌10分钟。 与阵列的滑动放入陪替氏培养皿和15毫升的接种的RMPI-1640培养基中加入。同时另一个幻灯片被放置在陪替氏培养皿中，并温育与非innoculatd的RPMI-1640作为对照。 相片数是在37℃下温育72小时的振荡在60rpm。 幻灯片用15毫升无菌PBS洗涤两次。 幻灯片洗涤两次，用15毫升无菌蒸馏水。 幻灯片空气干燥。 幻灯片成像使用GenePix自动加载磁带机的4200AL扫描仪（Molecular Devices公司，美国）与488 nm的激光激发和标准的蓝光发射滤波器（510-560nm处）。具有代表性的聚合物自体荧光图像如图2中所示。这应该是尽快完成，以避免腐烂的GFP。如果这是不可能的细胞应接受固定。此外，列入适当的阳性对照，用已知的细菌反应是必须要能够正常化的结果，并允许在不同的日子进行定量比较的实验。聚合物的荧光强度从点获得使用GenePix Pro 6的软件（Molecular Devices公司，美国）。这是为幻灯片培养细菌和媒体的。要查找的荧光由于细菌生长的介质上的控制的荧光中减去从与细菌孵育在幻灯片上的荧光测定。 幻灯片还可以染色20μMSYTO17核酸染料（Invitrogen公司，英国）在室温下30分钟，使用的是卡尔蔡司LSM 700激光扫描显微镜拍摄的2009年与ZEN成像软件（卡尔蔡司，德国）。细菌的覆盖范围的表面上使用开源图像J 1.44软件（国立卫生研究院，美国）。 6。代表性的成果印刷的条件进行了优化，打印最高质量的聚合物微阵列。湿度应保持在30％至40％之间。剥离的聚合物在含水环境中经常观察到的斑点印在低于30％的湿度的阵列，这表明此湿度不足以溶胀PHEMA层和允许的物理截留的聚合物基板。改变的聚合物点的直径，可以进一步增加的湿度，但，这是依赖于的单体化学。例如，对于聚合溶液的等体积的印刷和湿度上升至40％至80％的光点直径减小从430微米至370微米的单体含有亲水性的乙烯乙二醇部分等体积，而为莫nomer含有疏水性的脂族碳环结构的光点直径的增加从290微米至350微米（图5）。 的聚合度可以监视使用拉曼光谱测量的C = C的拉曼位移被检测到的在1640厘米-1，与在1720cm -1的C = O喇曼位移应被标准化。的拉曼光谱测定的聚合物聚合多样化的暴露于紫外线（图6）的点。 C = C：C = O比减少紫外线照射增加，从0到50秒，于是没有进一步下降的C = C：C = O比率进一步紫外线照射（图6）。拉曼光谱进行测定聚合物斑点在多样化的O 2的水平和C =Ç拉曼位移被观察到的O 2的水平降低至2000ppm，但是没有进一步降低，观察到的O 2低于这个水平（图7A聚合）。拉曼光谱的真空抽气S也展示了能力TEP，以除去未聚合的单体。到抽真空之前的C = C的拉曼位移是更大的聚合的聚合物用2000ppm的（图7A）相比，在3300 ppm的，然而，抽真空后的拉曼位移的高度是没有区别（图7B），这表明所有的未聚合的单体真空提取步骤期间已被移除。来概括，聚合条件包括30-40％的湿度，紫外线曝光大于50秒的O 2的水平低于2000ppm与印刷后7天的真空提取步骤。 印刷和真空萃取后的成功聚合物的聚合点可以通过简单的光学显微镜的识别和异常点形态评估。通常情况下，斑点出现圆形和均匀的，在左侧上的图8中所示。几何形状的变化，可能的原因是损坏或不洁针。对于一个小数量的单体的组合，我们已经观察到畸形斑点，为电子xample一个大的顶部有一个中央点的中央位置，如图8所示，在右侧的小斑点，或一个煎鸡蛋形状的卫星，平坦的位置。这可能是由于通过相分离有关的单体的粘度，亲水性，波动或表面张力的差异，并建议该单体的组合是不兼容这种格式打印之前。的技术（如TOF-SIMS）的聚合物点的附加化学映射也是一个重要的和有时是必要的质量控制步骤，以确定材料的化学成分的分布跨越的斑点和阵列。该技术可以识别一些不可见的光镜的材料的过度蔓延，并确定在个别的聚合物景点相分离。 图1原理图描绘涉及的各个步骤中形成的口服lymer点。 图2。引脚的印刷方法，包括初始加载的引脚与单体在源板，然后在基板上沉积单体接触的示意图。 XYZ机器人手臂的控制引脚。插图示出了典型的图像从生产后的数组中的自发荧光。 图3。示意图HTSC生物测定施加到聚合物微阵列研究与突出的技术。 图4的细菌附着试验的示意图。 图5，P印刷olymer光斑直径在多样化的湿度为两种不同的单体：4 – 叔丁基环己基丙烯酸酯，二（乙二醇）乙基醚甲基丙烯酸酯。 图6的拉曼强度的比例的C = C的拉曼位移1640cm-1 处的C = O从4 -叔丁基环己基丙烯酸酯的聚合物点具有不同的紫外线暴露在1720cm -1的喇曼位移。误差棒相当于一个标准偏差（n = 3）。 图7的 Raman光谱测定聚合物斑点印在多样化的O 2的水平的4 -叔丁基环己基丙烯酸酯，左侧的各频谱表示，（A）的前和（B）后，抽真空。的C = C的拉曼位移1640cm-1 处和C = O的喇曼位移在1720cm -1的拉曼强度的比率</su对>所示的各频谱的权利。 图8。光镜图像的两种聚合物的斑点。左边示出了形成良好的点上的光斑，而右侧上的光斑是含有单体的分布很不均匀的点的一个例子。比例尺为500μm。