El VisioTracker es un sistema automatizado para el análisis cuantitativo de los resultados visuales de peces adultos de larvas y pequeños basados en el registro de los movimientos oculares. Cuenta con un control total sobre propiedades de los estímulos visuales y análisis en tiempo real, permitiendo la investigación de alto rendimiento en áreas como el desarrollo del sistema visual y la función, la farmacología, los estudios neuronales del circuito y la integración sensoriomotora.
Las investigaciones sobre el desarrollo del sistema visual y la función necesario cuantificar los modelos de comportamiento de los resultados visuales que son fáciles de obtener, robusto y fácil de manipular. Un modelo adecuado se ha encontrado en la respuesta optocinético (okr), un comportamiento reflexivo presente en todos los vertebrados, debido a su valor de alta selección. El okr implica lento siguientes estímulos movimientos de ojos rápidos alternados con movimientos sacádicos reposición. La medición de este comportamiento es fácil de llevar a cabo en las larvas de pez cebra, debido a su aparición temprana y estable (completamente desarrollado después de 96 horas después de la fecundación (HPF)), y se benefician de los conocimientos a fondo sobre el pez cebra genética, desde hace décadas uno de los modelos favorecidos organismos en este campo. Mientras tanto, el análisis de mecanismos similares en peces adultos ha adquirido mayor importancia, particularmente para aplicaciones farmacológicas y toxicológicas.
A continuación se describe VisioTracker, un sistema totalmente automatizado, de alto rendimiento del sistema de análisis cuantitativos de rendimiento visual. El sistema se basa en investigaciones llevadas a cabo en el grupo del Prof. Stephan Neuhauß y fue re-diseñado por Sistemas de EET. Se trata de un dispositivo de inmovilización para los peces pequeños controlados por una cámara de vídeo de alta calidad, equipado con una lente de zoom de alta resolución. El contenedor de pescado está rodeado por una pantalla de tambor, en el que los patrones generados por computadora estímulo puede ser proyectada. Los movimientos del ojo se registran y analizan de forma automática por el paquete de software VisioTracker en tiempo real.
El análisis de datos permite el reconocimiento inmediato de parámetros tales como la duración de la fase lenta y rápida, la frecuencia del ciclo de movimiento, el aumento lento de la fase, la agudeza visual y la sensibilidad al contraste.
Los resultados típicos permiten, por ejemplo, la rápida identificación de los mutantes del sistema visual que no muestran ninguna alteración evidente en la morfología de tipo salvaje, o la determinación de los efectos cuantitativos de agentes farmacológicos o tóxicos y mutagénicos en el rendimiento del sistema visual.
La importancia de la okr para el estudio de la función visual ha sido reconocido en la comunidad científica desde hace mucho tiempo (Semana Santa y Nicola 1996, 1997), y los intentos de cuantificar realmente el paradigma de haber comenzado más de una década atrás. Semana Santa y Nicola (1996) desarrolló un sistema motorizado con tambores rotativos de rayas, donde se analizó la grabación de vídeo de movimiento de los ojos de forma manual. Este sistema sufrió de la falta de inmovilización de los embriones de pez, que requiere reposición manual frecuente, y puede detectar los movimientos de seguimiento de los ojos sólo con gran dificultad. Un paso adelante fue el uso de un tambor rayado video-proyectado para permitir una mayor presentación de estímulos variables generadas por ordenador (Roeser y Baier, 2003;. Rinner et al, 2005a).
La mayor parte manual, cuadro a cuadro el análisis de grabaciones en vídeo ha demostrado ser extremadamente difícil, y hasta cierto punto, obstaculizado por el sesgo del observador (Beck et al., 2004). El análisis automatizado en tiempo real, se sugirió que se permita el uso de mecanismos de retroalimentación del comportamiento de aprendizaje (al Mayor et al., 2004). El uso de la iluminación infrarroja y la frecuencia de los estímulos controlados de rotación ha sido promovida por Beck et al. (2004). Sin embargo, el sistema descrito no sólo se ha utilizado para las larvas, y el análisis se llevó a cabo fuera de línea. Además, el VisioTracker permite un control completo sobre los estímulos, incluyendo el cambio de los estímulos durante el experimento, lo que permite una mayor flexibilidad y la influencia espontánea en el transcurso del experimento. Además, la creación de estímulo digital utilizado por el VisioTracker superó los problemas mencionados anteriormente con la aceleración de la masa inerte de un tambor de estímulo a rayas (Beck et al., 2004).
Restricción de las larvas de metilcelulosa no interfiere significativamente con el movimiento del ojo y no tiene ningún efecto a largo plazo sobre el bienestar del pez cebra. Las larvas de peces se han mantenido con éxito incrustado en metilcelulosa durante varios días, hasta el suministro de oxígeno a través de la piel se vuelve insuficiente para la demanda que aumenta la edad (Qian et al., 2005).
El método de restricción de peces adultos es igual de fácil en el animal. La corta duración del experimento, junto con la opción de intercambiar rápidamente el animal de experimentación para uno diferente, se suma a los aspectos de bienestar de los animales positivos del sistema. Desde las branquias están continuamente bañadas por el agua, es conveniente pico el agua con cualquier producto químico de elección para estudiar su efecto sobre los movimientos de los ojos y el rendimiento visual. Del mismo modo un experimento de lavado se puede añadir sin la necesidad de manejar el animal entre los experimentos.
Ruido de los píxeles de la imagen de vídeo se ha minimizado por los algoritmos de suavizado del software VisioTracker de propiedad, lo que permite mediciones de alta precisión de la posición del ojo y la velocidad angular. Además, para facilitar el análisis estadístico, el software filtra los movimientos sacádicos que se producen a una velocidad fija y que no contribuyen a la declaración experimental. El promedio de curvas de velocidad de más de 7 fotogramas de vídeo facilitado su posterior análisis.
El VisioTracker abre una nueva dimensión para muchos campos de investigación variados. El sistema y sus predecesores ya han sido utilizados con éxito para cuantificar el rendimiento visual en larvas de pez cebra, utilizando parámetros como la agudeza visual, sensibilidad al contraste y la adaptación a la luz (Rinner et al., 2005a, Schonthaler et al., 2010), para el análisis funcional de conos siguientes manipulación de los miembros de la cascada de transducción visual (por ejemplo, Rinner et al, 2005b, Renninger et al, 2011..), o el análisis de los defectos visuales en las larvas de pez cebra mutante (por ejemplo, Schonthaler et al, 2005, 2008,. Bahadori et al., 2006). La interdependencia de la maduración morfológica y funcional del sistema visual ha sido estudiado por las mediciones okr para mostrar que la agudeza visual es todo, pero no completamente limitado por espacio de fotorreceptores en la etapa larval (Haug et al., 2010).
El VisioTracker es adecuado para analizar la función visual en adultos de pez cebra y otras especies de peces de tamaño parecido (Mueller y Neuhauß (2010), este informe).
También es concebible utilizar el sistema en áreas de investigación tales como la toxicología o farmacología que las sustancias a investigar podrían añadirse al flujo de agua alrededor de las branquias de peces adultos. Además, la versatilidad de VisioTracker permite realizar análisis más a fondo, por ejemplo, de ontogenetics de la función visual, la función de circuitos neuronales y el desarrollo, o sensitivomotora de control (véase la revisión de Huang y Neuhauß, 2008).
The authors have nothing to disclose.
KPM fue apoyada por la UE del 7 º PM (RETICIRC).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
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Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0387 |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 |
35 mm cell culture dish | Corning | 430165 |
Serum pipette | Greiner bio-one | 612 361 |
VisioTracker | TSE Systems | 302060 |